本文介绍了一种简单、经济且有效的果蝇胚胎活体成像样品制备方法。我们的实验方案可维持湿度并实现气体交换，且不会压迫果蝇胚胎。该方法适用于在体视显微镜或直立型复式显微镜下对表达GFP的果蝇胚胎进行活体成像分析。
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本文内容
摘要
摘要
基于绿色荧光蛋白（GFP）的延时活体成像技术是研究组织形态发生、细胞间黏附或细胞死亡等动态过程的遗传调控机制的有力手段。表达GFP的果蝇胚胎可方便地通过体视显微镜或共聚焦显微镜进行成像。任何活体成像实验方案的目标都是尽量减少脱水和缺氧等不利影响。以往用于准备果蝇胚胎以进行活体成像分析的实验方案通常包括将去壳胚胎置于卤代烃油中，并将其夹在一层可透过卤代烃气体的透气膜与盖玻片之间。1-3. 以这种方式通过封片压缩胚胎引入了压力，这为任何基于生物力学的形态发生分析带来了不希望出现的复杂性。我们的方法称为悬滴法，可在活体成像过程中保持胚胎极佳的存活率，且无需对胚胎施加压缩。简而言之，悬滴法涉及将胚胎置于一滴悬浮在盖玻片下方的卤代烃油中，而该盖玻片则固定于湿润培养 chamber 上方。这种装置除了可实现气体交换并防止脱水外，还利用了胚胎在卤代烃油中的浮力，防止其在延时成像过程中发生位置漂移。本视频详细介绍了如何利用悬滴法收集和制备果蝇（Drosophila）胚胎以进行活体成像。该方案适用于对去壳胚胎使用体视显微镜或任何直立型复合荧光显微镜进行成像。
方案
准备
- 在标准的葡萄汁琼脂平板上收集胚胎4。使用自动果蝇卵收集器（Flymax Scientific Equipment Ltd.）较为方便。采用同步化、分阶段的胚胎收集方法可减少为获得足量目标发育阶段胚胎而需进行的去壳操作次数。
- 通过在载玻片上粘贴一段双面胶带制备去壳载片；移除胶带背衬。
- 通过裁剪一块适合培养 chamber 孔径大小的组织来制备活体成像 chamber。将组织放入孔中，并用蒸馏水润湿。
- 按1:1比例混合卤碳油（Halocarbon Products Corp.）粘度系列700和系列56。该混合液可长期储存并重复使用。
- 在盖玻片（22 × 40 mm，No. 2）表面放置数小滴卤碳油。体积无需精确，但建议每滴约为20–40 µl。
步骤
- 在体视显微镜辅助下，使用珠宝镊子（5号）或极细的画笔从葡萄汁琼脂平板上收集胚胎。胚胎容易相互粘连，并粘附在镊子尖端，因此常成团聚集。
- 在体视显微镜辅助下，轻轻将粘附在镊子尖端的胚胎团块放置到去壳载片的胶带表面。
- 再次使用体视显微镜，用镊子侧面轻推或轻拂胚胎，以打开外层蜡质卵壳，同时避免破坏内层的卵黄膜（若卵黄膜破裂，胚胎会爆裂）。
- 一旦外层卵壳被打开，小心将胚胎从卵壳中分离；去壳后的胚胎容易粘附在镊子表面。注意避免让去壳胚胎接触胶带表面。
- 一旦胚胎完成去壳，立即迅速将其转移至盖玻片上预先准备好的碳氟油液滴中。将携带去壳胚胎的镊子尖端接触碳氟油液滴表面，使胚胎脱离镊子进入油中。
- 确认胚胎已成功转移至油滴中。可在黑色背景下借助斜向照射的光纤光源，用肉眼观察确认。
- 在尝试去壳下一个胚胎前，需清除镊子上的油迹。若镊子表面沾有油，会降低对卵壳表面的抓力，使去壳操作更加困难。
- 去壳后的胚胎在碳氟油中具有浮力。在体视显微镜下，使用镊子或画笔将胚胎推至油滴底部，并调整至所需位置。
- 迅速将盖玻片翻转覆盖在活体成像室的孔腔上。确认胚胎以所需方向紧贴盖玻片。由于在油中的浮力作用，胚胎将上浮并紧贴盖玻片的下表面。用胶带将盖玻片固定在活体成像室上，并在胶带覆盖盖玻片末端与成像室孔腔末端之间的间隙处打孔，以实现通气。
- 现在可使用正置荧光显微镜或荧光体视显微镜对胚胎进行成像。
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讨论
我们介绍了一种用于活体成像分析的黑腹果蝇胚胎制备新方法，称为悬滴法。遗憾的是，若使用倒置显微镜，则无法应用悬滴法。在此情况下，必须采用夹心法（如上文摘要所述），而胚胎受压问题仍然需要关注。
在通过测量细胞形态和大小以计算与形态发生运动相关的作用力的实验中，由于能够减少胚胎受压，使用正置显微镜和悬滴法更为可取。 此外，采用悬滴法减少胚胎受压会呈现出胚胎圆形、无变形的表面，而夹心法呈现的则是扁平化的表面。 因此，在使用共聚焦显微镜时，相较于夹心法，采用悬滴法需要采集更宽的Z轴堆栈（每堆栈包含更多切片）。 然而，每个Z轴堆栈中切片数量的增加，也会延长采集时间，并加剧激光激发所导致的光毒性或光漂白效应。 显然，减少压缩所带来的实验优势在一定程度上被Z轴堆栈采集时间的延长所抵消。 尽管如此，我们观察到采用悬滴法时胚胎仍具有良好的存活率。
悬挂液滴法还仅限于通过荧光显微镜观察胚胎，因为在这种情况下，入射光和发射光的光路不会穿过活体成像室。若要使用微分干涉差（DIC）显微镜或其...
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致谢
我们衷心感谢加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）为B.H.R.提供的发现基金以及研究工具与仪器基金。同时感谢H. Oda和布卢明顿果蝇品系中心提供用于示例活体成像序列的遗传品系。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 用于通过悬滴法准备活体成像胚胎的标准设备和材料包括以下物品：显微镜载玻片 | |||
| 盖玻片（22 × 40 mm，No. 2） | |||
| 双面胶带 | |||
| 珠宝商’Dumont 5号镊子 | |||
| 卤代烃油系列56和系列700（Halocarbon Products Corp.） | |||
| 美工刀或单刃剃刀刀片 | |||
| 纸巾 | |||
| 剪刀 | |||
| 蒸馏水 | |||
| 通用胶带 | |||
| 适用于移取 20-40 的移液器 μl. | |||
| 活体成像实验还需要一个自制的活体成像室。该成像室通过将一块5 mm厚的聚碳酸酯塑料板切割成标准显微镜载玻片的尺寸（75 × 25 mm），并使用旋转工具在载玻片上制作一个深3 mm、大小为20 × 55 mm的凹槽而制成。实验还需配备体视显微镜（解剖显微镜）和光纤照明光源。 |
参考文献
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
- Schock, F., Perrimon, N. Cellular processes associated with germ band retraction in. , 248-2429 (2002).
- Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis. Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).
- Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. Drosophila: a practical approach. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).
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