一种高通量全局研究酿酒酵母细胞器形态的方法

摘要

GFP融合蛋白被广泛用于通过共聚焦显微镜观察细胞器。然而，筛选影响细胞器形态的突变通常需要单独进行诱变，耗时较长。在此，我们展示了一种方法，可将细胞器-GFP标记物同时整合到酵母中近5000个非必需基因中。

摘要

高通量方法用于检测蛋白质定位或细胞器形态，是研究蛋白质相互作用的有效工具，有助于全面理解分子通路。在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，随着非必需基因敲除文库的发展，我们可以在不同基因背景下利用GFP（或其变体）标记，全局性地研究内质网（ER）和线粒体等不同细胞器的形态。然而，将GFP标记逐一引入各个单基因突变体中是一个劳动密集型过程。本文描述了我们实验室常规使用的一种方法：通过使用机器人系统处理高密度酵母阵列并结合药物筛选技术，可显著缩短实验时间并提高可重复性。简言之，我们利用机器人复制针印技术，将带有GFP标记的线粒体标记物（Apc1-GFP）与包含4,672个非必需基因敲除突变体的高密度阵列进行杂交。通过二倍体筛选、孢子形成、萌发及双标记筛选，我们获得两个等位基因。结果表明，每个单倍体单基因突变体均在其基因组位点整合了Apc1-GFP。由此，我们可在所有非必需基因突变背景下研究线粒体形态。利用这一高通量方法，我们能够在全基因组范围内便捷地研究并阐明参与细胞器遗传与形成的通路及相关基因。 关键词：高通量方法，蛋白质定位，细胞器形态，酿酒酵母，非必需基因敲除文库，GFP标记，线粒体，Apc1-GFP，机器人系统，药物筛选，全基因组分析

方案

材料与方法：

1. 酵母菌株：
   • Acp1-GFP（GFP::His）：通过使用质粒pKT128（含有GFP和His标签）进行PCR介导的同源重组，实现Acp1的C末端GFP标记。 HIS5阳性转化子通过共聚焦显微镜和菌落PCR确认。菌株背景为Boone实验室提供的BY7043（MAT alpha can1∆::STE2pr-lue2 lyp1∆ his3∆1 leu2∆0 ura3∆0 met15∆0）（Tong和Boone，2006）。
   • 缺失突变体阵列（DMA）（xxx::KanR）：该阵列包含约5,000个非必需基因的缺失突变体，所有非必需基因均在G418抗性条件下被敲除。该阵列的菌株背景为BY4741（MATa his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0）。我们的DMA最初来自Boone实验室。
2. 在DMA中整合Acp1-GFP：
   
   以下构建GFP阵列的实验方案改编自合成遗传分析（Synthetic Genetic Analysis, SGA）技术（Tong和Boone，2006），并进行了修改。所有复制点样步骤均使用Singer ROTOR高密度阵列机器人系统完成。也可选用手工点样或基于液体处理的高密度阵列机器人系统。
   
   缩写：YPD，酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖；SD，合成完全缺失培养基；LRK，亮氨酸/精氨酸/赖氨酸缺失培养基；LHRK，亮氨酸/组氨酸/精氨酸/赖氨酸缺失培养基
   
   准备
   1. 在YPD平板上倒入5 ml过夜培养的Acp1-GFP菌液，形成均匀菌苔。将平板置于火焰旁或生物安全柜中，充分干燥。
   2. 在30˚C下过夜孵育平板。
   3. 使用机器人将 Acp1-GFP 菌株以每板 1536 个菌落的形式点样到平板中。同时，通过复制针印迹法将 DMA 转移至 YPD + G418 平板，制备新鲜的 DMA 复制板。
   4. 在30˚C下过夜培养平板。
      
      交配与二倍体筛选
      
      
   5. 将 Acp1-GFP 菌株与 DMA 通过复制针印迹法在 YPD 平板上进行菌落交配。
   6. 30˚C下孵育平板过夜。
   7. 将菌落复制接种到 SD – His + G418 平板上，以筛选二倍体细胞（MATa/MATalpha）。
   8. 在 30˚C 下孵育平板过夜。
      
      孢子形成与萌发
      
      
   9. 将二倍体菌落影印接种到平板上 增强型产孢培养基，其中碳源和氮源含量较低，以诱导减数分裂孢子的形成。
   10. 将培养板在25˚C下孵育至少5天。
   11. 通过将菌落复制平板接种到YPD培养基上，使MATa减数分裂子代萌发 LRK 培养基 在30˚C下孵育平板两天。
   12. 该培养基将诱导单倍体细胞从孢子中萌发。由于 LUE2 开放阅读框（ORF）被整合至特异于MATa的STE2启动子中，因此所有萌发的单倍体均为MATa型。
       
       等位基因的双重选择
       
       
   13. 现在需要同时筛选出GFP等位基因和单突变等位基因。为此，将MATa细胞复制接种到 LRK + G418 培养基，用于筛选携带基因缺失（xxx::kanR）的单倍体细胞。
   14. 在30˚C下过夜培养平板。
   15. 最后，将 MATa 减数分裂子代通过影印接种法转移至 LHRK + G418 培养基 用于筛选携带 Acp1-GFP（GFP::His）的单突变体（xxx::kanR）生长。这些平板可在 4˚C 保存长达 3 个月。
   
   
   以下构建GFP阵列的实验方案改编自合成遗传分析（Synthetic Genetic Analysis, SGA）技术（Tong和Boone，2006），并进行了修改。所有复制点样步骤均使用Singer ROTOR高密度阵列机器人系统完成。也可选用手工点样或基于液体处理的高密度阵列机器人系统。
   
   缩写：YPD，酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖；SD，合成完全缺失培养基；LRK，亮氨酸/精氨酸/赖氨酸缺失培养基；LHRK，亮氨酸/组氨酸/精氨酸/赖氨酸缺失培养基
   
   准备
3. 显微镜技术
   1. 直接从平板上挑选表达 Acp1-GFP 的目标突变体。
   2. 在 YPD 或 SD – His 培养基中，于 30 °C 培养细胞至对数生长期初期。
   3. 使用GFP滤光片通过共聚焦显微镜观察。预期结果示例见图1。

SGA 培养基：

本实验方案中使用的生长培养基（YPD）和筛选培养基（SD）在酵母分子生物学中常规使用。详细描述请参见Methods in Yeast （Amberg 等，2005）。

LRK、LHRK 培养基（共 400 ml）

按顺序添加	用量
含硫酸铵的酵母氮源基础培养基	2.7 g
氨基酸混合物	0.8 g
琼脂	8 g
dH2O	360 mL
高压灭菌
20 % 葡萄糖	40 ml
冷却至 65˚C
100 mg/ml 刀豆氨酸	0.2 ml
100 mg/ml 硫代赖氨酸	0.2 ml
混匀，每皿倒入 50 ml

LRK、LHRK + G418 培养基（共 400 ml）

依次加入	量
不含硫酸铵的酵母氮源基础培养基	0.7 g
氨基酸混合物	0.8 g
谷氨酸钠	0.4
琼脂	8 g
dH2O	360 mL
高压灭菌
20 % 葡萄糖	40 ml
冷却至 65˚C
100 mg/ml 刀豆氨酸	0.2 ml
100 mg/ml 硫代赖氨酸	0.2 ml
200 mg/ml G418	0.4 ml
混合，每皿倒入 50 ml

富集孢子培养基（共400 ml）

依次加入	量
乙酸钾	4 g
酵母提取物	0.4 g
葡萄糖	0.2 g
孢子形成氨基酸混合物	0.04 g
琼脂	8 g
dH2O	360 mL
高压灭菌
冷却至 65˚C
200 mg/ml G418	0.4 ml
混合，每皿倒入 50 ml

讨论

该方法可高效地将线粒体标记物 Acp1-GFP 引入多种突变背景中。该方法依赖于机器人系统的使用，且可轻松适配于任何机器人系统。 本实验流程也可用于引入其他类型的标记物。例如，为观察内质网，我们常规使用标记物 Erg11-GFP。在我们的代表性图像中，通过共聚焦显微镜观察携带 Acp1-GFP 标记物的突变株和野生型菌株，以研究线粒体形态。该突变株表现出线粒体表型异常，因此是进一步研究的良好候选对象。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SGA 培养基			本实验方案中使用的生长培养基（YPD）和合成缺陷型培养基（SD），包括 LRK 和 LHRK，以及富集型产孢培养基，均为酵母分子生物学研究中常规使用的培养基。详细描述请参见《酵母实验方法》（Amberg 等，2005）。