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斑马鱼全胚胎高分辨率双荧光标记 原位 杂交

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DOI：

10.3791/1229

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2009年3月25日

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, Yale University

本文内容

摘要

整体原位杂交是发育生物学中最常用的技术之一。本文中，我们介绍一种高分辨率的双荧光原位杂交实验方案，用于分析单个基因的精确表达模式，并确定两个基因表达区域的重叠情况。我们同时包含碘化丙啶核复染步骤，以突出显示组织结构。

摘要

整体装片in situ杂交技术是发育生物学中应用最广泛的技术之一。在这里，我们介绍一种高分辨率的双荧光in situ用于分析单个基因的精确表达模式以及确定两个基因表达区域重叠的杂交实验方案。该方案是标准版本的改良版in situ使用碱性磷酸酶及NBT/BCIP和Fast Red等底物进行杂交1,2. 本方案采用标准的地高辛和荧光素标记探针，并结合酪胺信号放大技术（TSA）3. 市售的TSA试剂盒支持灵活的实验设计，可将从绿色到远红光范围的荧光发射与多种核染料（如碘化丙啶）或蛋白质的荧光免疫组织化学染色联合使用。TSA产生一种反应性荧光底物，可快速共价结合至标记反义核糖探针附近区域的基团（通常是酪氨酸残基）。由此产生的染色模式具有高分辨率，可通过激光扫描共聚焦显微镜观察mRNA的亚细胞定位。3,4. 可以观察到染色体位点上的新生转录本，区分细胞核与细胞质的染色，并可视化其他模式，例如 mRNA 的皮层定位。相关研究在Drosophila表明大约70%的mRNA表现出特定的亚细胞定位模式，这些模式通常与所编码蛋白质的功能相关联5. 当与计算机辅助的三维共聚焦数据集重建相结合时，本方案可实现对整个脊椎动物胚胎中 mRNA 分布进行亚细胞分辨率的详细分析。

方案

1. 固定

  1. 在4°C下用含4%多聚甲醛（PFA）的PBS固定胚胎过夜。
  2. 去除固定液，用PBS洗涤2次，每次5分钟，室温进行。
  3. 在玻璃凹孔板中的PBS内，使用钟表匠镊子手动去除胚胎的卵膜。去膜后，使用火焰抛光的玻璃巴斯德移液管转移胚胎，因为胚胎可能粘附于聚丙烯移液管。
  4. 将胚胎依次转移至含25%、50%和75%甲醇的PBS溶液中，每步各5分钟。
  5. 将液体替换为100%甲醇，孵育5分钟后，再更换为新鲜甲醇。
  6. 将胚胎置于-20°C下至少1小时。（我们通常孵育过夜。标准原位杂交在储存超过一年的胚胎上仍可进行，但我们尚未考察荧光原位杂交的高分辨率是否因长期储存而降低。）
  7. 在室温下，依次用含75%、50%、25%甲醇的PBST各洗涤5分钟；随后在PBST中再洗涤2次，每次5分钟。
  8. 在室温下，用含4% PFA的PBS再次固定20分钟。
  9. 在室温下，用PBST洗涤2次，每次5分钟。

关于PFA的注意事项：
我们将4% PFA分装后保存于–20ºC（见试剂表）。进行初次固定时，仅使用从未冻融过的PFA。后续固定中，通常使用已冻融过的PFA。根据本实验方案，初次固定对成功染色尤为关键。

2. 蛋白酶处理与后固定

  1. 在室温下用蛋白酶K（5μg/ml，溶于PBST）消化3至12分钟，以通透胚胎。（孵育时间取决于胚胎的发育阶段，较年轻的胚胎更敏感；同时也取决于酶的不同批次。）对于体节形成期的胚胎，通常通透3-4分钟。在此孵育过程中，我们将微量离心管侧放。
  2. 用PBST短暂漂洗，再在PBST中洗涤一次，每次5分钟。
  3. 在室温下用4%多聚甲醛（PFA）溶于PBS中再次固定20分钟。
  4. 在室温下用PBST洗涤两次，每次5分钟。

3. 预杂交

  1. 在 HYB- 中于 65º C 孵育胚胎 5 分钟。
  2. 在 HYB+ 中于 65º C 预杂交至少 1 小时。

4. 杂交

  1. 除去预杂交液（preHYB）中除 50 μl 以外的全部液体，但需确保胚胎始终完全浸没。
  2. 向胚胎中加入 1–2 μl 的每种核糖探针（地高辛标记和荧光素标记的核糖探针），并通过轻轻弹动管壁混匀。通常每种探针的用量为 20 μl 探针合成反应产物中的 1–2 μl。
  3. 由于荧光素对光敏感，从此时起应将管子用铝箔包裹，或尽可能避免暴露于光照条件下。
  4. 在 65ºC 下将胚胎孵育过夜。

5. 探针移除

请注意，从此步骤开始的溶液中不再含有去污剂。去除去污剂似乎有助于染色反应，但会导致胚胎变得较为粘稠。

  1. 移除核糖探针。
  2. 在 65ºC 下用 50% 甲酰胺/2xSSC 溶液洗涤 2 次，每次 30 分钟。
  3. 在 65ºC 下用 2 x SSC 溶液洗涤 15 分钟。
  4. 在 65ºC 下用 0.2 x SSC 溶液洗涤 30 分钟。

6. 抗荧光素抗体孵育

  1. 在500μl含2%封闭试剂的1×马来酸缓冲液中，室温下封闭至少1小时（参见试剂表）。
  2. 按1:500比例，将罗氏公司提供的抗荧光素-POD抗体加入封闭液中。
  3. 4ºC下孵育过夜。孵育期间，我们将微量离心管侧放。
  4. 用1×马来酸缓冲液洗涤4次，每次20分钟；再用PBS洗涤2次，每次5分钟。

7. 荧光素标记探针的检测

  1. 在 TSA Plus Fluorescein 溶液中孵育 30–60 分钟。（配制染色液前需离心 TSA 底物。反应时，将酪胺试剂用 Perkin Elmer 放大稀释缓冲液按 1:50 稀释。）孵育期间，我们将微量离心管侧放。每种探针的反应时间需通过实验确定。由于底物具有荧光，染色反应过程中会观察到普遍的绿色荧光，因此无法通过肉眼监测反应进程。
  2. 分别用含 30%、50%、75% 和 100% 甲醇的 PBS 溶液各洗涤 10 分钟。
  3. 在含 1% H2O2 的甲醇溶液中孵育 30 分钟，以灭活第一种过氧化物酶。
  4. 分别用含 75%、50% 和 30% 甲醇的 PBS 溶液各洗涤 10 分钟，然后在 PBS 中洗涤两次，每次 10 分钟。必须确保完全去除所有甲醇。

关于酪酰胺信号放大技术的说明：
我们一直使用 Perkin Elmer 的 TSA 试剂盒。我们发现，Alexa-Tyramide 底物在使用 Perkin Elmer 的扩增稀释缓冲液时染色效果良好，但在使用 Invitrogen/Molecular Probes 试剂盒所提供的染色缓冲液时未能获得成功。最后，我们发现后续的甲醇/2O2 处理过程中荧光素和Alexa-647不受影响，而Cy3可能受到甲醇/H的不利影响。2O2 处理，因为其结构与Cy5相关。因此，在双重荧光原位标记实验中，Cy3和Cy5 TSA反应应仅用于第二轮染色反应。

8. 抗地高辛抗体孵育

  1. 在室温下，用含有2%封闭剂的1×马来酸缓冲液再次封闭胚胎，至少1小时。
  2. 按1:1000比例，将Roche公司提供的抗DIG-POD抗体加入上述封闭液中。
  3. 在4°C下孵育过夜。孵育期间，我们将微量离心管侧向放置。
  4. 用1×马来酸缓冲液洗涤4次，每次20分钟；再用PBS洗涤2次，每次5分钟。

9. 地高辛标记探针的检测

  1. 在TSA Plus Cy5溶液中孵育30-60分钟（配制染色液前需离心TSA底物。反应时，将酪胺试剂用扩增稀释缓冲液按1:50稀释）。孵育期间，我们将微量离心管侧放。每种探针的反应时间需通过实验确定。
  2. 用PBST洗涤三次，每次10分钟。

10. 碘化丙啶染色

  1. 用 2 x SSC 溶液洗涤两次，每次 5 分钟。
  2. 在 37°C 下，将胚胎在含有 10 μl RNA酶（终浓度为 100 μg/ml）的 50 μl 2 x SSCT 溶液中孵育 30 分钟。
  3. 在室温下用 2 x SSC 溶液洗涤六次，每次 3 分钟。
  4. 用含 330 µg/ml 碘化丙啶的 2 x SSC 溶液对胚胎染色 8 分钟。
  5. 在室温下用 2 x SSC 溶液洗涤六次，每次 3 分钟。
  6. 在室温下用含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液固定 20 分钟。
  7. 在室温下用 PBST 溶液洗涤两次，每次 5 分钟。

11. 封片

  1. 将胚胎分别在含25%和50%甘油的PBST中各孵育10分钟，随后在4ºC条件下用75%甘油透明过夜。
  2. 解剖并去除胚胎的卵黄，然后将其平铺在显微镜载玻片上。卵黄可能产生较强的背景荧光。胚胎经甘油过夜透明后，解剖操作会更容易进行。

溶液：

PBSTPBS 加 0.1% Tween 
SSCTSSC 加 0.1% Tween 
HYB-50% 甲酰胺
5xSSC
0.1% Tween-20		 
HYB+HYB-
5 mg/ml 酿酒酵母（torula）RNA
50 μg/ml 肝素		酿酒酵母RNA通过蛋白酶K消化RNA，随后进行苯酚、苯酚-氯仿和氯仿抽提制备。RNA经沉淀后溶解于DEPC处理的水中。
1 x 马来酸缓冲液150 mM 马来酸，100 mM NaCl（pH 7.5） 

斑马鱼胚胎中 deltaC、her1 基因的荧光显微镜图像；基因表达模式。

图1. 整体双荧光原位杂交的代表性结果。（A-C）图像显示了十体节期斑马鱼胚胎后部区域的单个共聚焦切片。视角为背侧观，上方为头端。用碘化丙啶染色的细胞核呈蓝色。（A）使用地高辛标记的核糖探针和TSA-Cy5试剂检测deltaC mRNA。（B）使用荧光素标记的核糖探针和TSA-荧光素试剂检测her1基因转录的mRNA。（C）合并绿色和红色通道可明确识别两个基因表达区域的独立或重叠分布。（D, E）her1表达的细节，展示了该方法的高分辨率。mRNA的亚细胞定位清晰可辨。箭头指示一个正在进行活跃转录的细胞，其细胞核内出现染色点状信号。箭头指示一个显示mRNA胞质定位的细胞。（F, G）对her1和deltaC的双重染色揭示了同时转录两个基因的细胞（白色箭头），或仅单独转录其中一个基因的细胞（红色和绿色箭头）。

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讨论

本文所述方案适用于在典型的碱性磷酸酶介导反应中染色30-45分钟后产生清晰强信号的探针。在进行荧光原位杂交实验前，我们始终使用标准的非荧光检测方案（补充材料中提供了该方案以及探针合成方案）对探针进行测试。当使用较弱的探针时，荧光原位杂交方案的成功率较低，但在某些情况下仍可能实现。我们已成功将荧光原位杂交方案与β-catenin的免疫定位技术结合使用3。在进行此项改进时，我们将HYB-、HYB+及杂交孵育步骤的温度设为55°C而非65°C，因为在较低温度下表位的保存效果更佳。免疫定位孵育步骤在TSA反应之后进行。

由于荧光素标记的探针通常比同一基因的地高辛标记探针信号较弱，因此我们通常先检测荧光素标记的探针。只有在两种基因中某一基因表达水平较低的情况下，才可能需要优先检测地高辛标记的探针。此时，应对表达较弱的基因使用地高辛标记的核糖探针，并优先进行染色，以最大化信噪比。需要注意的是，如果随后再检测荧光素探针，则不应使用荧光素TSA法来检测地高辛探针，因为抗荧光素抗体会同时识别TSA染色产物和荧光素标记的核糖探针。

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致谢

我们谨感谢 Dörthe Jülich、Jennifer Round 和 Andrew Mara 在本实验方案开发过程中所做出的贡献。本研究得到了美国国立儿童健康与人类发展研究所（NICHD）、美国癌症协会和美国出生缺陷基金会的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16% 甲醛溶液，电镜级Electron Microscopy Sciences15710用 1.33x PBS 稀释至 4%（终浓度为 1x）。分装成 2 ml 每份，于 –20°C 保存
蛋白酶 K，重组 PCR 级Roche Group03115879001用去离子水配制成 20 mg/ml 的储存液。分装成 1 ml 每份，于 –20°C 保存
封闭试剂Roche Group11096176001用 1x 马来酸缓冲液配制成 10% 储存液。分装成 50 ml 每份，于 –20°C 保存。可耐受多次冻融循环。
抗荧光素-POD，Fab 片段Roche Group11426346910分装后于 -20°C 保存。取一份作为工作液置于 4°C 使用。
抗地高辛-POD，Fab 片段Roche Group11207739910同上。
TSA Plus 荧光素系统PerkinElmer, Inc.NEL741001KT仅在需要时配制 TSA 试剂。用 60μl DMSO 溶解。4°C 保存。
TSA Plus 花菁5系统PerkinElmer, Inc.NEL745001KT同上
TSA Plus 花菁3系统PerkinElmer, Inc.NEL744001KT同上
TSA 试剂盒 #16 AlexaFluor647 酪胺（含 HRP-羊抗兔 IgG）Molecular Probes, Life TechnologiesT20926将酪胺试剂溶于 150μl DMSO 中，分装后于 –20°C 保存。
RNase，无 DNaseRoche Group11119915001以 500μg/ml 溶液形式提供
碘化丙啶Molecular Probes, Life TechnologiesP-3566以 1 mg/ml 水溶液形式提供

参考文献

  1. Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
  2. Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, 345-358 (2001).
  3. Jülich, D. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
  4. Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).
  5. Lecuyer, E. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).

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标签

mRNA RNA

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