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斑马鱼全胚胎高分辨率双荧光标记 原位 杂交

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DOI：

10.3791/1229

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2009年3月25日

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, Yale University

本文内容

摘要

整体原位杂交是发育生物学中最常用的技术之一。本文中，我们介绍一种高分辨率的双荧光原位杂交实验方案，用于分析单个基因的精确表达模式，并确定两个基因表达区域的重叠情况。我们同时包含碘化丙啶核复染步骤，以突出显示组织结构。

摘要

整体装片in situ杂交技术是发育生物学中应用最广泛的技术之一。在这里，我们介绍一种高分辨率的双荧光in situ用于分析单个基因的精确表达模式以及确定两个基因表达区域重叠的杂交实验方案。该方案是标准版本的改良版in situ使用碱性磷酸酶及NBT/BCIP和Fast Red等底物进行杂交1,2. 本方案采用标准的地高辛和荧光素标记探针，并结合酪胺信号放大技术（TSA）3. 市售的TSA试剂盒支持灵活的实验设计，可将从绿色到远红光范围的荧光发射与多种核染料（如碘化丙啶）或蛋白质的荧光免疫组织化学染色联合使用。TSA产生一种反应性荧光底物，可快速共价结合至标记反义核糖探针附近区域的基团（通常是酪氨酸残基）。由此产生的染色模式具有高分辨率，可通过激光扫描共聚焦显微镜观察mRNA的亚细胞定位。3,4. 可以观察到染色体位点上的新生转录本，区分细胞核与细胞质的染色，并可视化其他模式，例如 mRNA 的皮层定位。相关研究在Drosophila表明大约70%的mRNA表现出特定的亚细胞定位模式，这些模式通常与所编码蛋白质的功能相关联5. 当与计算机辅助的三维共聚焦数据集重建相结合时，本方案可实现对整个脊椎动物胚胎中 mRNA 分布进行亚细胞分辨率的详细分析。

方案

1. 固定

  1. 在4°C下用含4%多聚甲醛（PFA）的PBS固定胚胎过夜。
  2. 去除固定液，用PBS洗涤2次，每次5分钟，室温进行。
  3. 在玻璃凹孔板中的PBS内，使用钟表匠镊子手动去除胚胎的卵膜。去膜后，使用火焰抛光的玻璃巴斯德移液管转移胚胎，因为胚胎可能粘附于聚丙烯移液管。
  4. 将胚胎依次转移至含25%、50%和75%甲醇的PBS溶液中，每步各5分钟。
  5. 将液体替换为100%甲醇，孵育5分钟后，再更换为新鲜甲醇。
  6. 将胚胎置于-20°C下至少1小时。（我们通常孵育过夜。标准原位杂交在储存超过一年的胚胎上仍可进行，但我们尚未考察荧光原位杂交的高分辨率是否因长期储存而降低。）
  7. 在室温下，依次用含75%、50%、25%甲醇的PBST各洗涤5分钟；随后在PBST中再洗涤2次，每次5分钟。
  8. 在室温下，用含4% PFA的PBS再次固定20分钟。
  9. 在室温下，用PBST洗涤2次，每次5分钟。

关于PFA的注意事项：
我们将4% PFA分装后保存于–20ºC（见试剂表）。进行初次固定时，仅使用从未冻融过的PFA。后续固定中，通常使用已冻融过的PFA。根据本实验方案，初次固定对成功染色尤为关键。

2. 蛋白酶处理与后固定....

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讨论

本文所述方案适用于在典型的碱性磷酸酶介导反应中染色30-45分钟后产生清晰强信号的探针。在进行荧光原位杂交实验前，我们始终使用标准的非荧光检测方案（补充材料中提供了该方案以及探针合成方案）对探针进行测试。当使用较弱的探针时，荧光原位杂交方案的成功率较低，但在某些情况下仍可能实现。我们已成功将荧光原位杂交方案与β-catenin的免疫定位技术结合使用3。在进行此项改进时，我们将HYB-、HYB+及杂交孵育步骤的温度设为55°C而非65°C，因为在较低温度下表位的保存效果更佳。免疫定位孵育步骤在TSA反应之后进行。

由于荧光素标记的探针通常比同一基因的地高辛标记探针信号较弱，因此我们通常先检测荧光素标记的探针。只有在两种基因中某一基因表达水平较低的情况下，才可能需要优先检测地高辛标记的探针。此时，应对表达较弱的基因使用地高辛标记的核糖探针，并优先进行染色，以最大化信噪比。需要注意的是，如果随后再检测荧光素探针，则不应使用荧光素TSA法来检测地高辛探针，因为抗荧光素抗体会同时识别TSA染色产物和荧光素标记的核糖探针。

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致谢

我们谨感谢 Dörthe Jülich、Jennifer Round 和 Andrew Mara 在本实验方案开发过程中所做出的贡献。本研究得到了美国国立儿童健康与人类发展研究所（NICHD）、美国癌症协会和美国出生缺陷基金会的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16% 甲醛溶液，电镜级Electron Microscopy Sciences15710用 1.33x PBS 稀释至 4%（终浓度为 1x）。分装成 2 ml 每份，于 –20°C 保存
蛋白酶 K，重组 PCR 级Roche Group03115879001用去离子水配制成 20 mg/ml 的储存液。分装成 1 ml 每份，于 –20°C 保存
封闭试剂Roche Group11096176001用 1x 马来酸缓冲液配制成 10% 储存液。分装成 50 ml 每份，于 –20°C 保存。可耐受多次冻融循环。
抗荧光素-POD，Fab 片段Roche Group11426346910分装后于 -20°C 保存。取一份作为工作液置于 4°C 使用。
抗地高辛-POD，Fab 片段Roche Group11207739910同上。
TSA Plus 荧光素系统PerkinElmer, Inc.NEL741001KT仅在需要时配制 TSA 试剂。用 60μl DMSO 溶解。4°C 保存。
TSA Plus 花菁5系统PerkinElmer, Inc.NEL745001KT同上
TSA Plus 花菁3系统PerkinElmer, Inc.NEL744001KT同上
TSA 试剂盒 #16 AlexaFluor647 酪胺（含 HRP-羊抗兔 IgG）Molecular Probes, Life TechnologiesT20926将酪胺试剂溶于 150μl DMSO 中，分装后于 –20°C 保存。
RNase，无 DNaseRoche Group11119915001以 500μg/ml 溶液形式提供
碘化丙啶Molecular Probes, Life TechnologiesP-3566以 1 mg/ml 水溶液形式提供

参考文献

  1. Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
  2. Jowett, T.

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标签

mRNA RNA

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