小鼠肾上腺嗜铬细胞分离

摘要

肾上腺髓质嗜铬细胞培养系统对于在体外研究兴奋-分泌耦联极为有用。本方案展示了如何解剖肾上腺，并通过剥离肾上腺皮质来分离髓质区域。随后演示了将髓质组织消化为单个嗜铬细胞的过程。

摘要

肾上腺髓质嗜铬细胞培养系统在体外研究兴奋-分泌耦联机制方面具有重要价值。本方案介绍了分离肾上腺并去除肾上腺皮质以获取髓质区域的操作方法。随后展示了将髓质组织消化为单个嗜铬细胞的过程。

方案

缩写：
ACCs - 肾上腺嗜铬细胞，E.Soln - 酶溶液，E.DMEM - 改良杜尔贝科必需培养基（含添加成分）

1. 准备
   1. 将木瓜蛋白酶加入所需体积的 E. Soln. 中（每 1 ml E. Soln. 加入 40 单位木瓜蛋白酶）。
   2. 在冰上用碳酰气活化木瓜蛋白酶约15分钟。 将Locke缓冲液置于冰上并通氧。
      
2. 解剖
   1. 使用8-10周龄小鼠。
   2. 消化前，去除含氧的Locke's缓冲液，并将样本置于冰上。
   3. 参见视频了解解剖步骤。
   4. 切除后，将腺体置于充氧的Locke's缓冲液中。
      
3. 腺体的制备
   1. 去除腺体中的脂肪组织。
   2. 剥离腺体的皮质部分。
      
4. 酶解消化
   1. 无菌滤膜过滤的含氧木瓜蛋白酶。
   2. 在培养皿上制备四份含氧的木瓜蛋白酶溶液。
      1. 3个池的体积应约为100微升。
      2. 1个样品池的体积应约为400 μl。
   3. 冲洗髓质组织并合并洗液
      1. 第1至第3个100微升样品池。
      2. 然后通过400 μl池
      3. 用移液器将300 μl E.Soln和来自400 μl混合液的延髓组织块转移至微量离心管中。
      4. 用封口膜封住微量离心管管口，置于37°C水浴中20分钟。
      5. 记得继续为含有木瓜蛋白酶的剩余 E.Soln 充氧。
      6. 20 分钟后，将更多的 E.Soln. 进行无菌过滤。
      7. 用新过滤的 E.Soln 替换浸泡髓质的旧 E.Soln。
         
5. 吹打混匀
   1. 吸出并弃去 E.Soln。
   2. 用1毫升E.DMEM洗涤髓质。
   3. 吸除并弃去 E.DMEM。
   4. 加入300 μl E.DMEM，用1 ml枪头吹打20次。
   5. 用无菌剃刀片切割200 μl枪头尖端。
   6. 用剪裁过的200 μl吸头吹打重悬5-10次。
   7. 弃去浸泡髓质组织块的 E.DMEM 培养液。  培养基中将含有碎片。
   8. 向髓质组织块中加入 300 μl 新鲜的 E.DMEM。
   9. 用200 μl枪头吹打20次
   10. 用移液器将 E.DMEM 加入不含髓质组织的微量离心管中。  培养基将含有游离的ACCs。
   11. 向髓质组织块中加入 300 μl 新鲜的 E.DMEM。
   12. 用23.5号注射器针头将延髓组织吹打20次。
   13. 将两次 triturations 得到的 E.DMEM 混合。  不应含有髓质组织碎片，此时应呈现羽毛状外观。
       
6. 铺板
   1. 将最后两次吹打步骤中的 E.DMEM 在 3.7g 下离心 2.5 分钟。
   2. 根据后续实验，用50–200 μL E.DMEM重悬沉淀。
   3. 将10-30微升样品置于玻璃盖玻片上。
   4. 等待15分钟，使细胞贴壁。
   5. 加入750 µl E.DMEM。