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1）显微外科手术的准备
- 手术区域需在摆放器械和辅助材料前用稀释的漂白剂溶液清洁并消毒。手术器械需在手术前一天进行高压灭菌，并存放于无菌容器中。开启用于在不同动物间手术操作时去除器械上病原体和微生物污染物的热珠灭菌器（Fine Science Tools）。
- 接通用于维持手术过程中动物体温的温控装置。准备好用于控制出血的棉签和纱布垫。准备小块（< 2mm3）明胶海绵，用于微血管止血，并将其浸入无菌生理盐水中。
- 将大鼠放入诱导室，用异氟烷（5% 氧气混合，流速 2.0 L/min）进行麻醉。将动物从诱导室移至准备台，剃除手术区域周围较大范围的毛发。从手术区域中心开始，用70%异丙醇向外周擦拭，随后以同样方式用聚维酮碘溶液（Xenodine）进行刷洗。重复此清洗程序3次。
- 将动物置于温控装置上，用吸入式面罩覆盖口鼻，将异氟烷浓度降至3%，流速调至0.2 L/min。通过皮下注射给予适当剂量的抗生素（氨苄西林），并通过肌肉注射给予镇痛剂（丁丙诺啡，0.05 mg/kg）。
- 术者使用聚维酮碘溶液刷洗手部，并用水冲洗。助手为术者穿上无菌手术衣，术者用无菌毛巾擦干双手后戴上无菌手套。本操作适用于本文所述的每一次手术程序。
- 由助手移除覆盖无菌器械的盖子，术者将器械摆放在无菌铺巾上。
2) 切断周围神经以促进其变性
- 将动物侧卧，从股骨头部向膝关节方向做一条直线切口，切口与股骨保持平行且距离约3 mm。沿皮肤切口相同路线切开浅层的股二头肌，以暴露下方的股外侧肌。
- 使用剪刀在靠近膝关节处的股外侧肌上做一小切口，并向上延伸至股骨头部。再次使用剪刀轻轻分离股外侧肌，直至可见坐骨神经的胫神经和腓神经合并分支（与股骨平行走行）。
- 沿这些分支向股骨头部方向追踪，直至识别出坐骨神经的主干。在坐骨神经分叉稍下方，用精细镊子小心分离包裹胫神经分支（较粗的分支）周围的结缔组织（神经外膜）。
- 一旦分离完成，将一根6-0丝线结扎线穿过胫神经并收紧。使用显微剪刀在结扎线近端（头侧）横断神经。将缝线穿过股外侧肌并打结固定。此缝线可作为标记，便于7–10天后取材时快速定位胫神经的切断端。
- 在移植前使胫神经发生变性，可创造比新鲜神经制备更有利于轴突生长的环境。
- 用6-0丝线缝合股外侧肌，再用6-0丝线缝合股二头肌，皮肤使用Michel伤口夹闭合。关闭异氟烷气流，移除吸入式鼻罩，将动物置于保温屏障上的暂养笼中，待其清醒并恢复活动后，送回饲养笼。
3) 去除PN节段
- 按上述步骤（1.3）麻醉动物，剃除并清洁预定手术区域。将动物置于保温屏障上。
- 取下伤口夹，分离先前的皮肤切口。切开浅层肌肉缝线以暴露股外侧肌，并在此肌肉中切开缝线。
- 沿缝线追踪至胫神经断端，从神经上移除缝线。用精细镊子剥离胫神经一段长15 mm的神经外膜，并切断该远端。取出神经节段并浸入无菌的Hanks平衡盐溶液中。
- 若为异体移植实验，通过腹腔注射Euthasol处死动物；若为自体移植实验，则按照2.6）所述方法关闭腿部肌肉和皮肤，并按以下描述准备进行颈椎脊髓损伤手术。
4) 颈部半横断损伤与移植
第1天
- 按上述步骤（1.3）麻醉动物，剃除并清洁预定手术区域。将动物置于隔热垫上。按上述方法（1.4）给予抗生素和镇痛剂。
- 定位枕骨切迹和明显的T2背侧椎体突起，在这两个体表标志之间做全长切口。沿斜方肌表层正中切开，并分离其下方的颈菱形肌。通过插入牵开器将肌肉保持分开状态。
- 应从C4、C5和C6背侧椎体突起处切断深层脊上肌。使用咬骨钳对C5进行部分椎板切除，以暴露脊髓右侧全部及左侧中线部分。以明显的背侧静脉作为脊髓中线的解剖标志。
- 使用显微手术刀片或30号针头刺破硬脊膜，并沿C5脊髓水平延长切口。在下方的蛛网膜下腔和软脑膜上做小切口。
- 使用拉制的玻璃微导管，施加轻柔压力，开始抽吸脊髓背侧右侧部分，同时使用显微镊子分离组织以促进其移除。继续操作至脊髓中间及腹侧部分，形成一个从背侧到腹侧、从中线至外侧脑膜贯通的长约2 mm的空腔。
- 将浸有生理盐水的明胶海绵填入空腔，以达到止血目的。
- 从Hanks溶液中取出周围神经段。轻轻剥离神经段近端3 mm处的神经外膜，并将此端贴合至半横断损伤空腔的头端壁。使用10-0缝线穿过神经外膜与硬脊膜固定神经段，随后将硬脊膜缝合，覆盖移植物的植入端。
- 用两片硅胶膜（Biobrane）将移植物夹合，以提供保护并便于后续时间点的分离。将其放置于C6、C7和T1椎体突起旁侧。切勿将神经远端贴附于脊髓或肌肉组织。
- 使用4-0缝线逐层缝合肌肉，使用伤口夹闭合皮肤切口。
- 将动物置于隔热垫上的饲养笼中，待其清醒且活动正常后，送回饲养笼。
第21天
- 按上述方法（1.3）麻醉动物，剃除并清洁预定手术区域。将动物置于保温屏障上，并按前述方法（1.4）给予抗生素和镇痛药。剪开表层缝线，暴露包裹神经移植物的硅胶膜。使用精细镊子和弹簧剪小心地将神经从硅胶膜中游离出来，并将其从手术区域牵开。
- 在C7椎体突右侧进行部分椎板切除术。按前述方法（4.4）刺破脑膜，通过抽吸在C7脊髓处制备一个1 mm3的背侧象限损伤空腔。使用生理盐水浸润的明胶海绵实现止血，随后更换为含软骨素酶ABC的浸润明胶海绵。对损伤部位处理15分钟，每5分钟更换一次新鲜的软骨素酶浸润明胶海绵。
- 用硅胶膜包裹神经移植物的外部长度。使用4-0缝线缝合浅层肌肉，用伤口夹闭合皮肤切口。将动物放置于保温屏障上的饲养笼中，待其清醒且活动正常后，送回原饲养笼。
第23天
- 按上述方法（1.3）麻醉动物，剃除并清洁预定手术区域。将动物置于保温屏障上，并按前述方法（1.4）给予抗生素和镇痛剂。剪开表层缝线，暴露包裹神经移植物的硅胶膜。不要扰动移植物，而是暴露C7移植物部位，使用带有拉制玻璃细管的汉密尔顿注射器，将1μl的软骨素酶ABC微量注射至脊髓右侧，位置约为移植物与脊髓连接处远端约1 mm处。
- 轻轻剥离神经段远端2 mm处的神经外膜，将此端对接至C7损伤腔。通过神经外膜以10-0缝线将神经段固定于硬脊膜上。
- 用4-0缝线缝合浅层肌肉，用伤口夹闭合皮肤切口。将动物置于保温屏障上的暂养笼中，待其清醒并恢复活动后，送回饲养笼。
5) 移植物及远端脊髓中动作电位的电生理记录
- 为了确定电活动是否通过已再生进入PNG的轴突进行传导，我们必须首先暴露并分离移植物。在该操作过程中需特别小心，避免对移植物造成物理性损伤，而移植物植入后使用Silastic膜的重要性正在于此。按上述方法（1.3）麻醉动物，剃除并清洁预定手术区域。将动物置于保温屏障上。
- 切开皮肤并分离浅层肌肉后，识别Silastic膜条，并小心地将其从移植物周围解剖分离。
- 使用咬骨钳去除PNG与脊髓对接部位头侧和尾侧相邻的椎板。在此过程中注意尽量不要扰动移植物。在上述两个水平的硬脑膜上切开小口。
- 在C5水平移植物与脊髓对接部位头侧约1 cm处，将一根单极刺激电极（铂-铱合金）插入损伤同侧的脊髓实质，深度约为1 mm。小心地将移植物中部轻轻抬起并置于双极钩状记录电极上。给予10 μA、持续100 μsec的单脉冲刺激，检测是否有动作电位通过已再生进入移植物的轴突传导。
- 交换电极导线连接方式和位置，使钩状电极变为刺激电极，而单极电极则插入PNG与脊髓对接部位远端的脊髓内，尝试在脊髓中记录由再生轴突引发的动作电位。
- 实验结束时，在50 Hz频率下给予持续1小时、每次1 mA、持续100 μsec的脉冲刺激序列。1小时后处死动物，用4%多聚甲醛灌注，随后处理脊髓组织，通过免疫细胞化学方法检测因PNG内再生轴突激活而表达cFos的神经元。
6) 对轴突再生进入 PNG 的神经元进行逆行标记，以及对轴突再生返回脊髓的神经纤维进行顺行标记
- 对于未进行电生理检测的动物，可确定长入移植物的轴突来源及其在脊髓中的终止走行。按上述方法麻醉动物，剃除并清洁预定手术区域（1.3）。将动物置于保温屏障上，并按上述6.1节所述暴露外周神经移植物（PNG）。
- 使用显微剪刀在移植物中点处切断，并从移植物切断端剥离并翻回神经外膜。将切断的两端彼此分开，分别置于独立的帕拉膜片上。
- 将一块浸有True Blue的明胶海绵敷料置于近端切断端，以标记贡献轴突至PNG的神经元；将另一块浸有生物素化葡聚糖胺（biotinylated dextran amine, BDA）的明胶海绵敷料置于远端切断端，以标记从移植物延伸回脊髓的轴突。
- 术后3–4天处死动物，用4%多聚甲醛灌注，取脑和脊髓组织切片，进行荧光显微镜检测以观察True Blue标记的神经元，或进行BDA组织化学染色以检测标记的轴突。
7) 胸段完全横断损伤与移植
这为上述的颈段半横断损伤模型提供了一种替代方法。在此方法中，制造出更为严重的双侧损伤，并将外周神经节段植入损伤脊髓的病灶腔内，以连接损伤脊髓的头端和尾端残端。
第1天
- 按上述方法（1.3）麻醉动物，剃除并清洁手术区域。将动物置于保温屏障上。按上述方法（1.4）给予抗生素和镇痛剂。
- 通过最后肋骨插入点确定第12胸椎（T12）水平。从此点开始，沿T11、T10和T9椎体突起向头侧做皮肤切口。切开浅筋膜，穿过附着于这三个突起的上脊肌。
- 对T10椎体突起进行完全椎板切除（覆盖T12脊髓节段）。使用显微手术刀片或30号针头刺破硬脑膜，并沿T12脊髓纵向延长切口。在下方的蛛网膜下腔和软脑膜上做一小切口。
- 使用拉制的玻璃微导管，施加轻柔压力并配合显微镊子分离组织，双侧吸除T12脊髓组织。继续操作至脊髓的中间和腹侧部分，形成一个从背侧到腹侧、位于两侧脑膜之间的3 mm长空腔。
- 使用生理盐水浸湿的明胶海绵实现止血，随后更换为含软骨素酶ABC的浸湿明胶海绵。在损伤部位处理15分钟，每5分钟更换一次新的软骨素酶浸湿明胶海绵。
- 从Hank's溶液中取出外周神经节段。轻轻剥离神经节段近端4 mm处的外膜，裁剪适当长度，使其紧密嵌合于脊髓一侧的头端和尾端残端之间。将第二个神经节段并置于第一个移植节段旁，对接至脊髓的另一侧。用缝线将硬脑膜闭合并覆盖移植部位，再以一小片硅胶膜覆盖硬脑膜。
- 用4-0缝线逐层缝合肌肉，用伤口夹闭合皮肤切口。
- 将动物置于保温屏障上的暂养笼中，待其清醒且活动正常后，送回饲养笼。
第3天
- 按上述方法（1.3）麻醉动物，剃毛并清洁预定手术区域。将动物置于保温屏障上，并按上述方法（1.4）给予抗生素和镇痛剂。剪开表层缝线，暴露移植物部位上方的硅胶膜。不要扰动移植物，而是暴露移植物远端的脊髓组织，使用带有拉制玻璃微管的汉密尔顿注射器，在移植物与脊髓交界处远端约1 mm的位置，向脊髓两侧各注射1μl的软骨素酶ABC。
- 用4-0缝线缝合浅层肌肉，用伤口夹闭合皮肤切口。将动物置于保温屏障上的暂养笼中，待其清醒且活动正常后，返回饲养笼。按照上述第5）和6）步骤进行电生理刺激与记录以及示踪剂标记。
8) 代表性结果
当该操作步骤得到优化时，外周神经节段将与宿主脊髓实现紧密整合。上行和下行的脊髓轴突将进入移植物，沿移植物长轴方向相对笔直地生长，并以大约每天1毫米的速度延伸至移植物的远端。如果已使用软骨素酶清除周围瘢痕组织中的抑制性蛋白聚糖，轴突在到达远端后将穿透相邻的脊髓组织。功能连接性的确定将依赖于电生理学和免疫细胞化学方法，检测脊髓神经元对移植物内轴突刺激所产生的反应。功能恢复的解剖学相关性将通过追踪已从神经移植物延伸回脊髓内部的轴突数量和长度来进行评估。