活细胞中F-肌动蛋白动态的荧光斑点显微成像（FSM）

摘要

通过荧光斑点显微镜（FSM）对荧光标记的F-肌动蛋白进行筛选、显微注射和成像。

摘要

在本实验方案中，我们描述了如何利用荧光斑点显微技术（Fluorescent Speckle Microscopy, FSM）对PtK1细胞中肌动蛋白的动态过程进行高分辨率成像。FSM的一个独特优势在于能够捕捉活细胞内F-actin网络的运动及其周转动力学（组装/去组装）。当该技术与计算机视觉分析软件结合使用时（定量荧光斑点显微技术，qFSM），特别适用于对F-actin动态进行定量测量。本文详细介绍了荧光标记肌动蛋白探针在活细胞中的筛选、显微注射及可视化方法。值得注意的是，类似的操作流程也可应用于其他大分子组装结构的观察。目前，FSM已成功用于微管、中间纤维以及黏着斑复合物的研究。 荧光斑点显微技术，肌动蛋白动态，F-actin，PtK1细胞，活细胞成像，显微注射，定量分析，大分子组装，微管，中间纤维，黏着斑复合物

方案

第1节：获取用于荧光显微术的荧光标记肌动蛋白

所需材料：纯化的肌动蛋白、荧光染料（推荐使用 Alexa、X-罗丹明）。G缓冲液、超速离心机

1. 获得高质量的荧光显微术（FSM）影像的关键在于使用您选择的荧光染料对肌动蛋白（或其他细胞骨架蛋白）进行适当的标记。
   我们建议使用 Alexa 系列（488、568 波长）以及靶向肌动蛋白表面暴露的赖氨酸残基的 X-罗丹明琥珀酰亚胺酯衍生物。
2. 在选择荧光染料及其相应波长时，请确保您的显微镜系统配备有合适的滤光片（激发和发射滤光片）和光源（汞灯和/或激光器），以适配所用的荧光标记物。我们建议选择橙色至红色波段（560–630 nm）的波长，以最大限度减少自发荧光和光损伤的影响，并确保其与 GFP 偶联物兼容。
3. 纯化肌动蛋白可从大鼠或鸡的肌肉组织中提取，但需通过肌肉丙酮粉进行耗时的提取流程。肌肉丙酮粉可从 Invitrogen 公司购买。本实验方案不讨论标记步骤，相关内容可参见此处[1]。
4. 或者，您也可以从多家供应商（如 Cytoskeleton Inc. 和 Invitrogen）直接购买已标记的肌动蛋白蛋白。Invitrogen 还提供定制标记服务。纯化的未标记肌动蛋白（包括肌肉型和非肌肉型肌动蛋白）也可从 Cytoskeleton Inc. 购得。
5. 无论您选择自行制备还是外购标记肌动蛋白，都应确保每个肌动蛋白单体上的染料标记比例在 0.3 至 0.7 之间。标记比过高可能影响肌动蛋白丝的周转动力学及其与相关蛋白的结合能力，而标记比过低则会导致荧光斑点质量差（信噪比低），并可能引起显微注射困难（见下文）。这是获得良好荧光斑点图像的关键因素。
6. 在长期储存前，应将标记的肌动蛋白溶液在 4°C 条件下以 75,000–80,000×g 离心 20 分钟以澄清溶液。标记的肌动蛋白应保存在 G-buffer 溶液中，并置于 -80°C 环境下。强烈建议将其分装为 2 µL 的小份，以减少反复冻融带来的不利影响（反复冻融会导致不溶性聚集体形成）。避免将标记的肌动蛋白溶液暴露于直射光下（会导致荧光染料发生光漂白）。我们建议使用不透光的微量离心管进行长期储存。

第2节：细胞制备及标记肌动蛋白的显微注射

所需材料：显微注射针、微量注射器、微量加样器、预热的细胞培养基、注射缓冲液、冰桶、显微镜（相位环、40倍相差物镜、显微注射仪、拉针仪、显微操作器）

1. 许多细胞类型适用于荧光斑点显微技术（FSM），但获得高质量的斑点图像直接取决于显微注射操作的成功与否。在选择用于 FSM 的细胞时，应选择体积较大（> 50 µm 直径）、贴壁后能良好铺展、且天然易于黏附于基质（或塑料培养皿）的细胞。若细胞的胞质区域大于细胞核面积，则更有利于操作。上述标准可确保细胞适合进行显微注射。合适的候选细胞系包括（但不限于）PtK1[2,3]、蝾螈肺细胞[4]和 Aplysia 神经元[3]。
2. 细胞应接种于经酸洗处理的方形玻璃盖玻片（22 × 22 mm；厚度编号 1-1/2）上。可在盖玻片上使用常规基质包被，且不会影响显微注射。
3. 显微注射针的选择取决于针尖开口的大小。通常，孔径可在 0.5 µm 至 3 µm 范围内变化。然而，我们建议肌动蛋白注射的最佳开口尺寸为 0.5 至 1 µm。若持续遇到堵塞问题，可采用更大孔径的针头，以利于单体肌动蛋白及意外聚合的肌动蛋白丝的输送。显微注射针可从多个供应商处购买，例如 Eppendorf 系统生产的 femtotip 显微注射针。或者，若有商用拉针仪，可从 Sutter 购买玻璃毛细管，并按需拉制。对于初学者，建议在开始注射前准备 10–20 根已拉制好的注射针。
4. 理想的“注射浓度”（即针头内装载的肌动蛋白最终浓度）应为 0.5 至 1.0 µg/µL，基于染料与肌动蛋白单体的标记比为 40%。若肌动蛋白的标记比较低，可通过提高注射浓度（1–3 µg/µL）进行补偿。但针头堵塞频率将随之增加。使用更大开口的针头可在一定程度上缓解此问题。肌动蛋白储备液可通过加入冰冷新鲜注射缓冲液进行稀释。冰冻去离子水（ddH₂O）也可用于快速注射前的稀释。此时所有工作液均应置于冰上保存。
5. 使用微量注射器（细径，Hamilton）或微量加样器吸头，吸取 0.5 至 1.0 µL 肌动蛋白溶液。
6. 小心释放溶液，缓慢排出肌动蛋白溶液。应避免产生气泡，但若出现气泡，可通过吸取气泡周围多余液体将其轻松去除。
7. 确保肌动蛋白溶液完全聚集在针尖处。若溶液残留在毛细管其他位置，可能干扰注射流。
8. 现在，小心将针头连接至注射器固定装置，注意避免触碰针尖。调整固定装置位置，使针头与显微镜载物台基面呈 35–50 度角。较低角度更佳。
9. 缓慢降低针尖，直至其刚好接触培养液表面。
10. 随后，在不进一步下降的情况下移动针尖，使其正对物镜中心上方。若针尖与物镜对齐，应能在目镜中看到一个明亮的光环，即针尖末端。缓慢左右移动针头（使用操纵器）有助于更准确地定位该光环。
11. 调节显微镜的 z 轴焦距，直至细胞清晰可见。然后缓慢降低针尖，使光环逐渐收缩并最终汇聚于针尖位置——此过程中需同步调节焦距（z 位置）。另一个可观察的特征是针杆，其会投射出线性阴影。继续降低针头可使针杆轮廓逐渐清晰。操作正确时，针尖末端与细胞均应清晰可见。可能需要轻微调节相差环以提高对比度。
12. 移动针头时，应确保针尖始终位于细胞上方，以防针尖断裂。
13. 选择待注射细胞时，应使具有自由边缘的细胞面向针尖。这可确保细胞厚度由最厚处（细胞核所在位置）向最薄处（前缘）呈递减斜坡，从而与针尖相交，而非平行于针尖。
14. 针头压力应设定在 0.3 至 0.8 psi。恒定压力将产生稳定的肌动蛋白溶液流。
15. 选定目标细胞后，将针头定位至细胞核附近（核周区域，即细胞最厚处，但细胞核不直接位于其下方）。
16. 缓慢下降并调整针头位置，直至针尖压向细胞膜，随后逐步降低，直至针尖刺穿细胞膜。若针尖已完全穿透细胞膜，细胞将立即变亮；一旦观察到此变化，应立即抬升针头，使其不再接触细胞。实际穿刺与注射过程耗时约 0.5 至 2 秒。
17. 操作正确时，细胞形态应无明显改变；若注射过量，则细胞边缘会迅速回缩，严重时甚至可见细胞破裂。
18. 若显微注射时未观察到细胞变化（未变亮），可能为针尖堵塞。若有“清洁”按钮，可按下测试。若针头通畅，恒定压力流将显著增强，目镜中可见波动现象，附近杂质亦会扩散。
19. 若针尖堵塞，可选择更换新的显微注射针，或尝试通过轻柔降低针头，使其尖端接触玻璃盖玻片，从而轻微折断针尖末端。断裂区域不应超过针尖锥形部分总面积的 1/5^th（即针头开始收窄至尖端的部分）。
20. 继续注射操作，每次显微注射会话时间不超过 20–45 分钟（具体时长取决于细胞类型）。一般建议采用较短会话时间，以尽量减少对细胞的应激。
21. 显微注射完成后，更换培养皿中的细胞培养液，加入新鲜预热的培养基。随后将细胞置于培养箱中恢复 30 分钟后再进行成像。此恢复期也有助于肌动蛋白整合至现有细胞骨架网络中。

第3节：组装成像室

所需材料：盖玻片、双面胶带、棉签、镊子、石蜡-羊毛脂混合物（valap）、无尘纸（kim wipe）、Oxyrase、成像培养基、剃刀刀片、P200移液器、纯乙醇

1. 首先将成像培养基预热，并解冻15 µL Oxyrase。注意保护对光敏感的Oxyrase免受光照。添加Oxyrase可显著减少光漂白效应。
2. 将电热板调至低温，预热瓦拉胶（valap）。切勿过热或烧焦瓦拉胶，否则会降低其作为密封剂的效果。
3. 用浸有纯乙醇的无尘纸（kimwipe）擦拭盖玻片，以清洁表面并去除微小碎屑。
4. 在干净平整的表面上，将两段等长（2.5 cm）的双面胶带叠放在一起。挤压排出其中夹带的气泡，形成完全平整的平面。
5. 使用刀片沿长轴方向切割出两条直边，使每条胶带宽度为0.5 cm。
6. 用镊子将每条胶带贴附在盖玻片的长边边缘，使两条胶带在盖玻片中央形成一个间隙。轻轻按压胶带，使其与玻璃表面形成良好密封。这些胶带将作为盖玻片与盖玻片之间的间隔物。
7. 在进行下一步操作前，确保瓦拉胶已完全液化。
8. 取出预热的成像培养基，每500 µL培养基中加入15 µL Oxyrase。
9. 将无尘纸折叠成三角形，形成三个硬边。该硬边用于为胶带提供干燥的粘附表面。
10. 从培养箱中取出细胞。用镊子夹住盖玻片一角，迅速将其放置在无尘纸上（细胞面朝上，不接触纸面），然后使用折叠好的无尘纸擦拭盖玻片相对的两侧，使细胞所在表面变为半干燥状态。
11. 用镊子夹住盖玻片一角，将其放置在盖玻片上，使干燥区域与两条胶带对齐。此时应形成两侧封闭、两侧开口的结构。缓慢地将200 µL含Oxyrase的成像培养基溶液通过移液器加入其中一个开口附近。重要的是不得引入气泡。溶液将通过毛细作用被吸入新组装的成像腔室中，从而使细胞完全浸没于溶液中。
12. 用棉签蘸取熔化的瓦拉胶，涂抹在盖玻片的四个角落，以快速固定并稳定盖玻片。你会注意到瓦拉胶在室温下几秒内即迅速干燥。
13. 现在从开口侧（非胶带侧）开始，用棉签以类似刷涂的方式涂抹一层薄薄的瓦拉胶。然后重复处理封闭侧。缓慢多次涂抹瓦拉胶，逐步加厚涂层以增强密封效果。瓦拉胶应仅限于边缘区域，保持盖玻片中心部分清晰无遮挡。
14. 用蘸有ddH₂O的棉签轻轻清洁盖玻片中心区域，去除残留的培养基，注意避免压碎细胞。随后用纯乙醇重复清洁步骤。
15. 此时你已获得一个完全封闭的成像腔室，适用于斑点成像（speckle imaging）。完全密封的环境可防止荧光染料快速发生光漂白。

第4节：细胞成像

所需材料：倒置宽场显微镜、汞灯、合适的滤光片、配备6.7微米像素的冷却CCD相机、高数值孔径油浸平场复消色差物镜（60倍至100倍，相差或微分干涉差成像）。防震台。成像软件。

1. 将显微镜载物台预热至 37 摄氏度。放置已完成的成像腔室，并等待 10–15 分钟，待温度稳定后再进行成像。
2. 首先使用明场模式对细胞进行聚焦，然后切换至正确的荧光设置以找到已注射的细胞。尽量减少荧光曝光时间，以降低光漂白效应。
3. 寻找具有健康弯曲前缘的注射细胞。过度注射的细胞（破裂细胞）表现为边缘回缩且呈锯齿状，类似大量丝状伪足——应避免对这类细胞进行成像。
4. 采集参数的设置取决于细胞类型、标记肌动蛋白的质量以及显微镜组件。然而，曝光时间不应超过 2 秒，帧间时间间隔应设置在 5 至 10 秒之间。一个时间序列（针对每个成像细胞）的典型持续时间通常在 10 至 30 分钟之间，具体受限于光漂白效应。可适当提高相机的增益设置以增强信噪比。
5. 理想的斑点特征应为每个斑点与其相邻斑点之间的距离约为 2 个斑点直径，从而确保对肌动蛋白结构实现最佳的空间和时间采样。在上皮细胞中，斑点状肌动蛋白网络呈现均一分布，斑点均匀分散。具有密集应力纤维或片状伪足的细胞系虽可区分，但会呈现点状或斑点状外观。应调整曝光参数以获得最佳的斑点图像。
6. 过度显微注射的细胞中，斑点密集堆积，无法分辨为独立个体。应力纤维和片状伪足将失去其点状外观。
7. 显微注射不足的细胞在目镜下显得非常暗淡，其斑点间距较大（>10 个斑点以上），且呈随机散在分布。这些细胞中的应力纤维和片状伪足难以分辨。
8. 获得“高质量”斑点动态影像的关键在于保持焦点稳定。这对于涉及斑点流动和周转率测量的后续分析尤为重要。因此，定量分析的质量取决于在延时成像全程中能否锁定焦点。若成像平面较薄，此操作可能尤为困难。其他影响因素还包括显微镜系统的稳定性，特别是载物台外壳和成像腔室的稳定性。若图像采集的时间间隔足够长，可采用基于对比度的自动对焦功能。其他选择包括购买基于近红外的对焦系统，以实现可靠的实时焦点调节。Nikon、Olympus 和 ASI 均提供此类产品。

第5节：qFSM分析

本部分未作详细讨论，但有关分析软件的信息可在此处找到[5]。软件下载请求可通过我们的网站（lccb.scripps.edu）提交。

涵盖主题：

• 噪声校准
• 散斑检测
• 采用混合方法进行追踪：基于图像相关的散斑区域整体运动追踪，结合单个散斑的单粒子追踪，以实现精细运动分析。
• 通过散斑出现和消失过程中的强度波动，计算聚合物的组装与解聚速率。

讨论

成功获取散斑图像有几个关键因素，但良好的散斑成像始于并最终取决于荧光标记肌动蛋白的质量。染料与肌动蛋白单体的标记比率应保持在0.4至0.7之间，以确保散斑明亮且离散；同时，标记后的蛋白质本身应具有良好的溶解性，并无聚集物。同样重要的是显微注射操作。为确保细胞正常的内环境稳态（及存活），需以较低的流体压力进行注射，引入低浓度的标记蛋白。这要求操作者对显微注射系统的使用具备一定程度的技术熟练度和经验。一般原则是，较短的注射时间（< 1秒）优于较长的注射时间。最后一个关键组成部分是显微镜。大多数核心设施中配备汞灯落射照明系统的倒置显微镜即可作为散斑成像的合适平台。假设已配置适当的荧光滤光片，高数值孔径（NA）物镜与冷却CCD相机的组合将可获得高分辨率的明亮散斑图像。我们建议使用高倍率（100倍）、高数值孔径（>1.3）的平场复消色差物镜，以提供更优的分辨率和亮度。在理想的注射条件下，放大倍数可降低至60倍，从而提高每个像素的亮度和信噪比。低噪声、高量子效率、带约6.5微米像素尺寸的冷却CCD相机是理想的探测器，在某些情况下甚至可以弥补荧光探针质量的不足。此外，荧光标记的蛋白探针可与cDNA构建体共注射（核内注射），以在同一细胞内表...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
注射缓冲液（IB） 50 mM 谷氨酸钾 0.5 M MgCl2 (附录 2A) 可储存长达 2 年 −20° C G缓冲液 2 mM Tris⋅Cl，pH 8.0（附录 2A) 0.2 mM CaCl2（附录 2A) 使用前立即加入： 0.2 mM ATP（参见100 mM配制方法） 0.5 mM 2-巯基乙醇–乙醇 4℃下最多可保存1天° C