活细胞中F-肌动蛋白动态的荧光斑点显微成像（FSM）

摘要

通过荧光斑点显微镜（FSM）对荧光标记的F-肌动蛋白进行筛选、显微注射和成像。

摘要

在本实验方案中，我们描述了如何利用荧光斑点显微技术（Fluorescent Speckle Microscopy, FSM）对PtK1细胞中肌动蛋白的动态过程进行高分辨率成像。FSM的一个独特优势在于能够捕捉活细胞内F-actin网络的运动及其周转动力学（组装/去组装）。当该技术与计算机视觉分析软件结合使用时（定量荧光斑点显微技术，qFSM），特别适用于对F-actin动态进行定量测量。本文详细介绍了荧光标记肌动蛋白探针在活细胞中的筛选、显微注射及可视化方法。值得注意的是，类似的操作流程也可应用于其他大分子组装结构的观察。目前，FSM已成功用于微管、中间纤维以及黏着斑复合物的研究。 荧光斑点显微技术，肌动蛋白动态，F-actin，PtK1细胞，活细胞成像，显微注射，定量分析，大分子组装，微管，中间纤维，黏着斑复合物

方案

第1节：获取用于荧光显微术的荧光标记肌动蛋白

所需材料：纯化的肌动蛋白、荧光染料（推荐使用 Alexa、X-罗丹明）。G缓冲液、超速离心机

1. 获得高质量的荧光显微术（FSM）影像的关键在于使用您选择的荧光染料对肌动蛋白（或其他细胞骨架蛋白）进行适当的标记。
   我们建议使用 Alexa 系列（488、568 波长）以及靶向肌动蛋白表面暴露的赖氨酸残基的 X-罗丹明琥珀酰亚胺酯衍生物。
2. 在选择荧光染料及其相应波长时，请确保您的显微镜系统配备有合适的滤光片（激发和发射滤光片）和光源（汞灯和/或激光器），以适配所用的荧光标记物。我们建议选择橙色至红色波段（560–630 nm）的波长，以最大限度减少自发荧光和光损伤的影响，并确保其与 GFP 偶联物兼容。
3. 纯化肌动蛋白可从大鼠或鸡的肌肉组织中提取，但需通过肌肉丙酮粉进行耗时的提取流程。肌肉丙酮粉可从 Invitrogen 公司购买。本实验方案不讨论标记步骤，相关内容可参见此处[1]。
4. 或者，您也可以从多家供应商（如 Cytoskeleton Inc. 和 Invitrogen）直接购买已标记的肌动蛋白蛋白。Invitrogen 还提供定制标记服务。纯化的未标记肌动蛋白（包括肌肉型和非肌肉型肌动蛋白）也可从 Cytoskeleton Inc. 购得。
5. 无论您选择自行制备还是外购标记肌动蛋白，都应确保每个肌动蛋白单体上的染料标记比例在 0.....

讨论

成功获取散斑图像有几个关键因素，但良好的散斑成像始于并最终取决于荧光标记肌动蛋白的质量。染料与肌动蛋白单体的标记比率应保持在0.4至0.7之间，以确保散斑明亮且离散；同时，标记后的蛋白质本身应具有良好的溶解性，并无聚集物。同样重要的是显微注射操作。为确保细胞正常的内环境稳态（及存活），需以较低的流体压力进行注射，引入低浓度的标记蛋白。这要求操作者对显微注射系统的使用具备一定程度的技术熟练度和经验。一般原则是，较短的注射时间（< 1秒）优于较长的注射时间。最后一个关键组成部分是显微镜。大多数核心设施中配备汞灯落射照明系统的倒置显微镜即可作为散斑成像的合适平台。假设已配置适当的荧光滤光片，高数值孔径（NA）物镜与冷却CCD相机的组合将可获得高分辨率的明亮散斑图像。我们建议使用高倍率（100倍）、高数值孔径（>1.3）的平场复消色差物镜，以提供更优的分辨率和亮度。在理想的注射条件下，放大倍数可降低至60倍，从而提高每个像素的亮度和信噪比。低噪声、高量子效率、带约6.5微米像素尺寸的冷却CCD相机是理想的探测器，在某些情况下甚至可以弥补荧光探针质量的不足。此外，荧光标记的蛋白探针可与cDNA构建体共注射（核内注射），以在同一细胞内表.......

材料

本文使用的材料清单

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注射缓冲液（IB） 50 mM 谷氨酸钾 0.5 M MgCl2 (附录 2A) 可储存长达 2 年 −20° C G缓冲液 2 mM Tris⋅Cl，pH 8.0（附录 2A) 0.2 mM CaCl2（附录 2A) 使用前立即加入： 0.2 mM ATP（参见100 mM配制方法） 0.5 mM 2-巯基乙醇–乙醇 4℃下最多可保存1天° C