in utero 和 ex vivo 电穿孔法用于小鼠视网膜神经节细胞中的基因表达

摘要

本文介绍了通过胎内（in utero）和离体（ex vivo）电穿孔技术操控小鼠视网膜神经节细胞（RGCs）基因表达的两种方法。这些技术可用于研究基因表达变化对RGC发育、轴突导向以及功能特性的影响。

摘要

视网膜及其唯一的输出神经元——视网膜神经节细胞（RGC）——是研究细胞分化、轴突导向、视网膜拓扑组织和突触形成等生物学问题的优良模型[1]。一个局限在于难以高效且可靠地调控RGC中的基因表达 体内，尤其是在其他方面易于研究的小鼠视觉通路中。转基因小鼠可用于调控基因表达，但这种方法通常成本高昂、耗时较长，且可能产生非预期的副作用。在鸡胚中，体内电穿孔技术被用于调控视网膜神经节细胞（RGCs）中的基因表达，以研究视网膜和RGC的发育。尽管类似的电穿孔技术已在新生小鼠[2]、成年大鼠[3]以及小鼠胚胎视网膜[3]中建立 体外[4]，但这些策略均无法对RGC的发育及轴突投射进行完整表征 体内为此，我们开发了两种电穿孔技术的应用，一种 在子宫内 以及另一个 离体，以特异性靶向小鼠胚胎期视网膜神经节细胞[5, 6]。

与 在子宫内 视网膜电穿孔，我们可在视网膜神经节细胞（RGCs）中实现特定基因的异常表达或下调，并追踪其轴突在视觉通路中的投射情况 体内，从而能够在中间靶点（如视交叉）或最终靶区（如外侧膝状体核）处研究轴突导向的决策过程。在整体野生型背景下，特异性干扰部分视网膜神经节细胞（RGCs）中的基因表达，有助于阐明该基因在视网膜通路中的功能。此外，我们还开发了一种配套技术，用于分析RGC轴突的生长情况 体外我们对外植的胚胎头部进行体外电穿孔，收集并培养整个视网膜，数天后从中制备视网膜组织块。视网膜外植块可用于多种体外实验，以检测经电穿孔转染的视网膜神经节细胞（RGC）轴突对导向信号或其他因子的反应。总之，这一系列技术增强了我们在RGC中实现基因错表达或基因下调的能力，将极大促进对RGC发育及轴突投射的研究。

方案

第1部分：in utero 和 ex vivo 视网膜电穿孔实验的准备工作

1. 对于两者 在子宫内 和 离体 视网膜电穿孔

• 使用电极拉制仪制备尖端细小的微电极，并打断尖端（或对尖端进行斜面处理）以形成倾斜的尖端。
• 将DNA溶液配制为所需浓度，并加入少量Fast Green染料（0.05%）以观察注射过程。我建议 5 μl 每位母亲的DNA溶液 在子宫内 视网膜电穿孔 1 μl 每个胚胎头部对应的DNA溶液 离体 视网膜电穿孔。加入GFP表达载体（或其他荧光蛋白）以可视化转染的神经元。
• 通过高压灭菌器对手术器械进行灭菌。
• 制备氯胺酮-赛拉嗪麻醉混合液，每只孕鼠配制约 0.2 ml，体积比为 1.0:0.2:4.6 100 μg/ml 氯胺酮：100 μg/ml 赛拉嗪：生理盐水。也可使用其他麻醉剂。

2. 对于 在子宫内 视网膜电穿孔

• 打开加热垫，并用尿布垫覆盖。
• 在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制抗生素-抗真菌素溶液（1:100），并置于加热垫上预热。每只孕鼠准备约 2 ml。
• 将经无菌过滤的 PBS 置于温水浴中保温。

3. 对于 离体 视网膜电穿孔

• 准备用于视网膜孵育的含氧无血清培养基（SFM）：将25 ml DMEM/F12培养基用95%氧气/5%二氧化碳混合气体通气处理至少2小时。向25 ml含氧培养基中加入0.25 g牛血清白蛋白（BSA）、250 μl ITS补充剂和50 μl青霉素-链霉素溶液。混匀使BSA完全溶解，然后经无菌滤器过滤。该溶液需在每次电穿孔实验前新鲜配制。
• 准备含0.4%甲基纤维素的SFM培养基用于视网膜外植体孵育：将0.20 g甲基纤维素加入含搅拌磁子的150 ml瓶中，高压灭菌。配制50 ml SFM（方法同上，无需通气），加入已灭菌的甲基纤维素瓶中。在4°C下混合过夜。次日经无菌滤器过滤后于4°C保存，该溶液可保存约1个月。
• 在视网膜外植体收获当天（第5部分），准备用于接种视网膜外植体的培养皿：用250 μl多聚-L-鸟氨酸在37°C下包被玻璃底培养皿至少2小时（也可在前一天包被，并于4°C孵育过夜）。用PBS多次洗涤培养皿，然后加入200 μl含10 μg/ml层粘连蛋白（laminin）的DMEM/F12溶液，在37°C下包被至少2小时。再用37°C的PBS多次洗涤培养皿，并保持在PBS中，直至外植体准备接种。
• 对于边界实验，先按上述方法用多聚鸟氨酸包被培养皿，然后将培养皿的一半用目的蛋白与荧光标记物共同包被2小时（37°C），以可视化边界（例如使用Alexa Fluor 555标记的BSA，稀释比例1:800）。用PBS洗涤后，再按上述方法加入层粘连蛋白。

第2A部分： 在子宫内 视网膜电穿孔：向E14.5小鼠视网膜注射并电穿孔导入DNA 关键词：视网膜电穿孔，DNA注射，E14.5小鼠视网膜，电穿孔，基因转染，发育生物学，神经发育，视网膜发育 体内

1. 向处于 E13.5–E14.5 阶段的母鼠腹腔（i.p.）注射 0.15 ml 麻醉混合液。母鼠通常需要 3–7 分钟达到外科手术麻醉水平。完全麻醉的小鼠在受到后肢足垫夹捏时不应有反应。
2. 在此期间，剪取一小片 Parafilm，并用移液器吸取约 5 µl DNA 溶液滴加到 Parafilm 上。将推杆（金属丝）弯成 90° 角，插入拉制好的微量移液管中。使用推杆将 DNA 溶液吸入微量移液管内（使用解剖显微镜可辅助此操作）。
3. 当母鼠达到外科手术麻醉水平后，使用电动剃毛器剃除其腹部约 2 英寸区域的毛发，随后将其背侧朝下放置于加热垫上。用酒精棉片擦拭剃毛区域，再用碘伏棉片至少擦拭两次，完成术区准备。在每只眼睛上滴加一滴眼科用 Vet 软膏，以防止母鼠在全身麻醉期间发生角膜溃疡。
   
4. 用镊子夹住皮肤，使用剪刀沿腹中线方向（长约约 1 英寸）切开皮肤和肌肉，暴露腹膜。用镊子提起腹膜，并沿相同方向做垂直切口，以暴露腹腔（图 1）。然后用纱布垫覆盖手术区域，防止腹腔内容物接触并被动物毛发污染。
5. 用镊子将皮肤和腹膜向后拉开，使用解剖 spatula 通过切口取出一个胚胎（选择最容易接近的胚胎）。将 spatula 置于两个胚胎之间，轻柔地将胚胎链从腹腔中拉出。也可用手将胚胎链拉出。
   *自此步骤起，须始终用无菌 PBS 保持胚胎湿润*
6. 将母鼠保持在加热垫上，置于解剖显微镜下，轻柔按摩胚胎，使其视网膜朝上。建议从最内侧或最外侧的胚胎开始操作，以便更清晰地记录哪些胚胎已完成电转染。
7. 用惯用手持微量移液管，另一只手固定胚胎。使用微量移液管穿过子宫壁和羊膜囊刺入视网膜。根据微量移液管的锋利程度，穿透子宫壁可能需要一定压力，但一旦穿透，移液管将进入胚胎并理想地到达视网膜。由于难以控制和判断移液管进入胚胎的深度，因此在刺穿膜结构后应尽量减少移液管的移动，以防扩大穿刺孔，导致羊水泄漏和胚胎死亡。应避免刺破子宫壁中的血管，以免引起出血和胚胎死亡。
8. 当确认微量移液管已进入视网膜后，即可将 DNA 溶液注入视网膜。缓慢推动推杆，同时逐渐撤出微量移液管，确保 DNA 沿移液管路径被注入，因为移液管常深入至视网膜深层。若已定位在视网膜，应将 0.5 μl（可通过移液管上的 1 μl 刻度标记测量）注入视网膜外层与视网膜色素上皮（RPE）之间的视网膜外间隙。应观察到绿色染料填充视网膜，并渗入羊水中（图 1）。
9. 电穿孔电极板在手术期间应保存在盛有 PBS 的培养皿中。轻柔地将电极板置于胚胎头部两侧，正极（+）电极板应位于注射眼的同侧。施加适度压力以固定头部，但切勿用力过猛，以免压破羊膜囊导致胚胎死亡。当电极就位后，以 60 Hz 频率施加 5 次 40 V、50 ms 的方波脉冲。由于电流可能逸散至皮肤和肌肉，母鼠出现轻微抽搐是正常现象。
10. 对每个需要注射和电转染的胚胎重复步骤 7–9。通常每只母鼠电转染 4–8 个胚胎，具体数量取决于 DNA 用量、胚胎数量、母鼠状态及麻醉时间。也可选择先集中注射多个胚胎，再统一进行电转染，而非逐个完成注射与电转染。
11. 完成胚胎电转染后，使用镊子和 spatula 将胚胎链重新放回腹腔。向腹腔内注入约 2 ml 抗生素-抗真菌溶液。
12. 使用止血钳和镊子缝合腹膜，从切口前段打双结开始，采用连续简单缝合方式缝至切口后段。最后以打结固定缝线，并剪除多余线头。
13. 为闭合切口进行缝合钉固定时，用钝头镊子提起切口前段的皮肤，注意将皮肤与腹膜分离。将缝合钉器的齿部环绕皮肤放置并按压钉合。沿切口向后端继续钉合，通常需要 5–7 枚缝合钉。用酒精棉片擦拭缝合钉周围的伤口。
14. 让母鼠在加热垫上恢复（通常需 15–90 分钟苏醒），当其开始翻身时，将其腹部朝上放入新笼中。
15. 为减轻疼痛与不适，母鼠在苏醒时接受布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg，s.c.）注射，若后续仍存在不适，可再次给药。为防止脱水，术后约 2–4 小时皮下注射（s.c.）1.0 ml 生理盐水，若当晚或次日仍需补充，可再次注射。术后 24 小时，母鼠应恢复正常行为，并能正常饮水和进食。

第2B部分：在体视网膜电穿孔 在E18.5阶段获取电穿孔后的视网膜

1. 在 PBS 中配制 4% 多聚甲醛（PFA），每个胚胎约需 5 ml。灌注可使用重力输液系统或注射泵进行。（或者，可将 E18.5 胚胎头部直接浸入 4% PFA 中过夜。）
2. 向母鼠腹腔注射 0.2 ml 麻醉混合液，并确保其完全进入麻醉状态。使用剪刀剪开皮夹下方的皮肤和腹膜，暴露腹腔和子宫角。
3. 取出电穿孔后的胚胎，将其腹侧朝上固定。切开腹部皮肤、腹膜、膈肌以及肋骨的侧部，以暴露心脏。将连接灌注装置的蝶形针头插入左心室，并用显微剪刀剪开右心房。启动灌注，使 PFA 流动约 60 秒；若灌注成功，血液将从右心房流出，胚胎逐渐变苍白。随后将胚胎断头，将头部放入含 4% PFA 的 15 ml 锥形管中。对所有电穿孔胚胎重复此操作。将头部于 4°C 条件下在 4% PFA 中固定过夜，之后在 PBS 中洗涤数天。在所有胚胎收集完毕后，通过颈椎脱臼法处死母鼠。

去除视网膜

4. 用 PBS 清洗后，将头部置于解剖皿中，使视网膜朝上，并浸入 PBS 中。去除视网膜周围的皮肤以暴露视网膜色素上皮（RPE）。使用 26G1/2 针头在晶状体与 RPE 交界处刺穿腹侧视网膜。将显微剪的一侧插入该孔中，沿腹侧视网膜垂直剪切至视盘。此切口有助于在取出视网膜时确定其方位。
5. 用尖头镊子去除 RPE。用一把镊子夹住腹侧切口处的 RPE，另一把镊子从 RPE 与晶状体交界处（RPE 紧密附着的位置）开始剥离 RPE。去除 RPE 后，用精细镊子夹住晶状体，向上提起并取出晶状体。用镊子夹住视神经乳头周围组织，夹断视网膜。将视网膜转移至盛有 PBS 的孔中，并记录每只视网膜来自哪只头部样本。
6. 对对侧视网膜及其他所有电转胚胎重复步骤 4–5。未注射的视网膜作为免疫染色的对照。
7. 使用荧光解剖显微镜扫描所有视网膜，检测 GFP+ 细胞（绿色视网膜）。对于所有显示 GFP+ 的视网膜，表明该胚胎的电转成功，这些视网膜及其对应的脑组织（视觉系统完整）可进行后续分析（如切片和免疫染色）（图 1）。

第3a部分： 离体 视网膜电穿孔 向E14.5小鼠视网膜注射并进行DNA电穿孔 体外

1. 用 0.2 ml 麻醉混合液对处于 E13.5–E14.5 阶段的母鼠进行麻醉，并确保其完全进入麻醉状态。使用剪刀剪开皮肤和腹腔，暴露胚胎。用镊子提起胚胎链，剪断结缔组织，将整个胚胎链从母体中完全取出。将胚胎链置于含 DMEM/F12 并置于冰上的培养皿中。通过颈椎脱位法处死母鼠。
2. 用显微剪刀剪开整个子宫壁，然后用镊子将每个胚胎从羊膜囊中取出，并夹除胎盘。将每个胚胎的头部剪下，并收集至另一含有 DMEM/F12 并置于冰上的培养皿中。
3. 使用口吸移液管或推杆式移液器，将所需量的 DNA 溶液（见第 1 部分）吸入微量移液针中。
4. 在本实验方案中，DNA 将被注射至视网膜周边背侧区域。通过调整 DNA 注射位点及电极板的位置，也可靶向其他视网膜区域。
5. 将一个头部转移至含 PBS 的解剖皿中，腹面朝下固定，使头部背侧向上。用镊子去除视网膜上方的皮肤。
6. 将微量移液针保持在与水平方向约呈 10° 的位置（基本与背侧视网膜曲率平行），将移液针推入视网膜色素上皮层（RPE），使针尖位于 RPE 与外层视网膜之间。向此间隙注入约 0.1–0.4 μl 的 DNA 溶液；绿色液体应可见充满整个间隙并从 RPE 的穿孔处渗出。对对侧视网膜重复注射操作。
7. 小心而迅速地移除固定针，并（保持头部浸没于 PBS 中）将电极板置于头部两侧，正极（+）电极板置于头部的腹侧。施加 4 次 40 V、50 ms 的脉冲，频率为 60 Hz，然后将头部放回含 DMEM/F12 并置于冰上的培养皿中（图 2）。
   
8. 对所有头部及所有 DNA 溶液重复步骤 5–7。完成所有电穿孔操作后，向 4 孔板中每孔加入约 1.5 ml 预先充氧的 SFM 溶液，并置于冰上（每种不同 DNA 溶液各用一孔）。
9. 将一个头部转移至含 DMEM/F12 的解剖皿中，使一侧视网膜朝上。在腹侧视网膜（或与靶区域相对的一侧），使用精细镊子夹住并撕开 RPE 形成小孔。将镊子一端插入此孔，从晶状体-视网膜连接处开始剥离 RPE，使其与视网膜分离。注意不要切割或损伤视网膜，以免在孵育过程中导致视网膜塌陷。去除 RPE 后，用镊子在视网膜基底部夹住视神经，将视网膜完整挤出（保持晶状体完整）。将视网膜转移至充氧的 SFM 中。翻转头部，对对侧眼重复上述操作。
10. 对所有经电穿孔处理的头部完成步骤 9。将视网膜在 37°C 下于充氧的 SFM 中孵育 40–48 小时。

第3b部分：离体视网膜电穿孔 电穿孔后2天收获并接种GFP+视网膜外植体

1. 将一个孔中所有含氧的无血清培养基（SFM）中的视网膜转移至含有 DMEM/F12 的培养皿盖中。选择一个视网膜，使用荧光解剖显微镜观察视网膜中 GFP+（绿色）部分。
2. 使用显微手术刀和镊子，切除并丢弃非 GFP+ 部分的视网膜，仅保留 GFP+ 的视网膜组织块。在整个解剖过程中，交替使用荧光和普通光源有助于准确选择 GFP+ 视网膜。将 GFP+ 视网膜转移至含有 DMEM/F12 的孔中。
3. 对来自同一孔的所有视网膜重复步骤 2。对于每个 DNA 处理条件（即每个不同的孔），均需使用新的培养皿和 DMEM/F12 培养基。
4. 现在需将这些 GFP+ 视网膜切割成更小的视网膜外植块用于接种。在解剖显微镜下，使用显微手术刀将较大的 GFP+ 视网膜组织切割为较小的外植块。外植块应呈矩形，长宽约为 200–300 μm。将所有外植块收集至含有 DMEM/F12 的孔中。一个 GFP+ 视网膜组织块通常可产生约 4–10 个 GFP+ 视网膜外植块，具体数量取决于组织大小。对所有已分离的 GFP+ 视网膜区域重复此步骤。
5. 在完成所有 GFP+ 视网膜外植块的制备后，向经层粘连蛋白包被的培养皿（见第 1 部分）中加入 250 μl SFM + 0.4% 甲基纤维素（保存于 4°C）。将 4–8 个 GFP+ 外植块转移至培养皿中，并使用镊子轻轻将其排列成多边形，使外植块位于培养皿中心与边缘之间的中点位置。
6. 确定外植块的 RGC 层所在面。有时 RPE 结晶会附着在视网膜外层，表明其对侧即为 RGC 层。此外，RGC 面通常残留一些细胞碎片，有助于正确判断外植块的方向。
7. 将 RGC 层朝下，用镊子用力按压外植块中心，使其牢固贴附于玻璃盖玻片上。镊子按压后可能在外植块上留下压痕，此现象属正常。
8. 在所有外植块接种完成后，将培养皿置于 37°C 培养箱中。接种后 4–6 小时可首次观察到视网膜轴突生长，外植块可维持数天健康状态，但 24 小时后可能出现明显过度生长。外植块可用于多种体外（in vitro）检测，可用 4% 多聚甲醛（PFA）固定 30 分钟后进行免疫染色（图 2）。

边界实验

8. 或者，将4个GFP+外植体转移至已为边界实验准备好的培养皿中（参见第1部分）。将外植体排列在培养皿中央的一条垂直线上，位置大致与边界重合。
9. 在荧光解剖显微镜下，将外植体接种至距离荧光边界约50–150 mm的位置。将培养皿在37°C条件下孵育24小时，以充分允许视网膜神经节细胞（RGC）轴突延伸至边界基质。外植体可用4%多聚甲醛（PFA）固定30分钟，随后进行免疫染色（图2）。

代表性结果

讨论

在本视频中，我们展示了电穿孔技术，包括 在子宫内 和 离体用于将基因递送至小鼠胚胎视网膜神经节细胞。 在子宫内 视网膜电穿孔为调控视网膜神经节细胞（RGCs）基因表达并可视化其轴突投射提供了有效手段 体内让胚胎在出生后存活，可使其GFP+ RGC轴突投射至靶区外侧膝状体核（LGN）的过程得以观察。 离体 视网膜电穿孔技术可更精确地靶向特定视网膜区域，适用于 体外 检测方法。结合 体内 和 体外 这些技术获得的分析结果能够在整体正常背景下，对部分视网膜神经节细胞（RGC）的发育及其轴突投射进行充分表征。尽管我们的演示重点在于视神经交叉处RGC轴突的导向，但两者 在子宫内 和 离体 视网膜电穿孔技术可能有助于研究基因表达扰动对视网膜神经节细胞分化、树突形态、电生理特性、突触形成以及在侧膝状体和上丘等终止区域中的精确投射所产生的影响。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BTX 电穿孔仪 ECM 830（带脚踏开关）	Harvard Apparatus	450052
圆形镊形电极	Nepa Gene	CUY650-5 或 CUY650-7
丝线缝合线	Henry Schein	101-2636
带推杆玻璃微量移液管	Drummond Scientific	5-000-1001-X10
抗生素-抗真菌剂	Invitrogen	15240096
DMEM/F12 培养基	GIBCO, by Life Technologies	11330057
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A8806-5G
ITS 添加剂	Sigma-Aldrich	I-1884
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140-122
甲基纤维素	Sigma-Aldrich	M0512
玻璃底细胞培养皿	MatTek Corp.	P35G-1.5-14-C
多聚-L-鸟氨酸	Sigma-Aldrich	P4957
层粘连蛋白	Invitrogen	23017-015