收获与制备 果蝇 用于电生理记录及其他实验操作的胚胎

摘要

该技术用于暴露果蝇胚胎的神经肌肉系统，以便进行免疫组织化学或电生理记录。它适用于研究神经肌肉发育的早期事件，或对无法孵化的突变体进行电生理实验。

摘要

Drosophila是研究胚胎发育和功能神经科学的首选遗传模型。传统上，这两个领域彼此孤立，拥有 largely 独立的历史和科学群体。然而，这些通常截然不同的领域之间的交汇点，正是在神经回路形成的最后阶段，功能性的电信号特性的获得以及功能性化学突触分化所依赖的发育程序。这一交汇点是研究中至关重要的领域。在Drosophila，这些功能发育阶段发生在胚胎发生最后三分之一时期的 <8 小时内（25°C 下）。由于表皮分泌了一层坚韧且不可渗透的角质层，这一晚期发育阶段长期以来被认为难以进行研究。一项突破性进展是应用了可与水聚合的外科胶水，该胶水可局部施加于角质层，从而实现对晚期胚胎的可控解剖。通过背侧纵向切口，可将胚胎展平，暴露腹侧神经索和体壁肌肉，以便进行实验研究。该系统已被广泛用于分离和鉴定影响胚胎突触形成的遗传突变体，从而揭示调控突触连接特化、分化以及功能性突触信号特性的分子机制。

方案

第1部分：设备与试剂

1. 进行胚胎解剖需要一台性能良好的解剖显微镜；建议使用40倍放大倍数，并配备25倍目镜以最大程度提高放大倍数。
2. 手动挑选胚胎及去除胚胎卵黄膜时，需使用精细镊子（5号）。
3. 需要配备制作和修整精细玻璃针的设备。解剖过程中需使用拉制的玻璃针。我们倾向于使用实心玻璃针（使用寿命更长），但标准的厚壁玻璃管（外径1–1.5 mm）同样适用。有些人使用精细的钨针，通过在1M NaOH溶液中电解 sharpen 至所需锋利度，电源为10安培以上的自耦变压器电池。 sharpened 钨解剖针的优点是相对坚韧且耐用。中空玻璃针（制备方式类似于膜片钳电极）连接塑料管，用于解剖过程中吸液和排出生理盐水，以及精确输送胶水。目前有多种玻璃拉针仪可用于制造玻璃针。计算机编程控制的拉针仪可预设多种形状和尺寸。Brown-Flaming型号（Sutter Instrument Co.）广受青睐。应配备一台复式显微镜（20–40倍物镜），用于在使用前检查和修整电极。
4. 解剖过程中常用的两种溶液用于浸泡胚胎组织：1）“标准”（Jan 和 Jan，1976a）或“改良标准”（Broadie，2000）生理盐水，其配方基于其他无脊椎动物系统电生理记录中常用的溶液；2）“类血淋巴”（HL）生理盐水（Stewart 等，1994），介于标准生理盐水与实测的黑腹果蝇（Drosophila）血淋巴离子浓度之间的一种折中配方。需注意的是，这些生理盐水均不能准确模拟体内血淋....

讨论

由于胚胎功能特性的成熟过程在短短数小时内迅速进行，因此精确的胚胎分期至关重要。然而，这一分期过程受到多个因素的复杂影响。首先，大多数研究人员采用定时产卵法来确定胚胎发育阶段，但不同条件下个体间的产卵时间可能存在极大差异（Broadie 等，1992）。特别是，饮食受限的雌性个体往往会在产卵前长时间滞留已受精的卵。因此，在收集卵子前，必须通过提供富含酵母的食物喂养雌性至少两天以“清除”其体内滞留的卵（Broadie 等，1992）。此外，年长的雌性个体在产卵前也会更长时间地保留卵子。年长雌性通常仅在卵孵化前几小时才产卵。因此，为了获得最一致的产卵时间，应使用年轻的雌性个体（<7 天龄）（Broadie 等，1992）。其次，在胚胎发育的晚期阶段，仅依靠形态学标准进行分期较为困难。大多数明确的分期特征在 <16 小时 AEL 时已基本完成（Campos-Ortega 和 Hartenstein，1985），而大多数功能性发育则发生在 >16 小时 AEL 之后。晚期发育特征（例如气管充气、表皮鞣化）较少，且在时间上的限制性较弱。基于上述原因，我们建议采用组合方法：通过 1–2 小时的定时产卵收集卵子，根据持续时间 <.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胚胎收集笼	Genesee Scientific	59-100（适用于60 mm培养皿；也可提供其他尺寸）	也可使用打孔的三口烧杯自制收集笼，视频中已展示
Sylgard 184	Dow Corning	可从多家公司获得	手术胶在涂有Sylgard的盖玻片上黏附效果更佳
细玻璃管，外径1.0–1.5 mm	Various		用于拉制精细玻璃针以进行解剖，以及制作胶水输送用的细管
塑料管，用于连接玻璃移液管以进行口吸和施加胶水	Tygon		塑料管内径需与玻璃管外径匹配