收获与制备 果蝇 用于电生理记录及其他实验操作的胚胎

摘要

该技术用于暴露果蝇胚胎的神经肌肉系统，以便进行免疫组织化学或电生理记录。它适用于研究神经肌肉发育的早期事件，或对无法孵化的突变体进行电生理实验。

摘要

Drosophila是研究胚胎发育和功能神经科学的首选遗传模型。传统上，这两个领域彼此孤立，拥有 largely 独立的历史和科学群体。然而，这些通常截然不同的领域之间的交汇点，正是在神经回路形成的最后阶段，功能性的电信号特性的获得以及功能性化学突触分化所依赖的发育程序。这一交汇点是研究中至关重要的领域。在Drosophila，这些功能发育阶段发生在胚胎发生最后三分之一时期的 <8 小时内（25°C 下）。由于表皮分泌了一层坚韧且不可渗透的角质层，这一晚期发育阶段长期以来被认为难以进行研究。一项突破性进展是应用了可与水聚合的外科胶水，该胶水可局部施加于角质层，从而实现对晚期胚胎的可控解剖。通过背侧纵向切口，可将胚胎展平，暴露腹侧神经索和体壁肌肉，以便进行实验研究。该系统已被广泛用于分离和鉴定影响胚胎突触形成的遗传突变体，从而揭示调控突触连接特化、分化以及功能性突触信号特性的分子机制。

方案

第1部分：设备与试剂

1. 进行胚胎解剖需要一台性能良好的解剖显微镜；建议使用40倍放大倍数，并配备25倍目镜以最大程度提高放大倍数。
2. 手动挑选胚胎及去除胚胎卵黄膜时，需使用精细镊子（5号）。
3. 需要配备制作和修整精细玻璃针的设备。解剖过程中需使用拉制的玻璃针。我们倾向于使用实心玻璃针（使用寿命更长），但标准的厚壁玻璃管（外径1–1.5 mm）同样适用。有些人使用精细的钨针，通过在1M NaOH溶液中电解 sharpen 至所需锋利度，电源为10安培以上的自耦变压器电池。 sharpened 钨解剖针的优点是相对坚韧且耐用。中空玻璃针（制备方式类似于膜片钳电极）连接塑料管，用于解剖过程中吸液和排出生理盐水，以及精确输送胶水。目前有多种玻璃拉针仪可用于制造玻璃针。计算机编程控制的拉针仪可预设多种形状和尺寸。Brown-Flaming型号（Sutter Instrument Co.）广受青睐。应配备一台复式显微镜（20–40倍物镜），用于在使用前检查和修整电极。
4. 解剖过程中常用的两种溶液用于浸泡胚胎组织：1）“标准”（Jan 和 Jan，1976a）或“改良标准”（Broadie，2000）生理盐水，其配方基于其他无脊椎动物系统电生理记录中常用的溶液；2）“类血淋巴”（HL）生理盐水（Stewart 等，1994），介于标准生理盐水与实测的黑腹果蝇（Drosophila）血淋巴离子浓度之间的一种折中配方。需注意的是，这些生理盐水均不能准确模拟体内血淋巴的实际化学组成（Broadie，2000）。标准生理盐水成分如下（单位为 mM）：135 NaCl、5 KCl、4 MgCl₂、1.8 CaCl₂、72 蔗糖、5 TES，pH 7.2。研究者也可考虑使用市售昆虫生理盐水（例如Schneider’s Insect Media），该溶液不适合电生理记录，但很可能更有利于保护暴露组织的健康状态。

第2部分：胚胎分期与解剖

1. 为了获得最佳的卵收集效果，应将年轻（<7天）、健康且数量为20-40只的雄性和雌性果蝇置于新鲜的产卵杯中培养2-3天。产卵杯通常由100 ml塑料烧杯（Tri-Pour）制成，底部打孔以保证足够的空气流通，并覆盖一个60 mm的琼脂平板。琼脂平板中含有用琼脂固化的苹果汁或葡萄汁。配方有多种，其中一种示例如下：700 ml水，25-30克琼脂，300 ml果汁浓缩液（葡萄或苹果），0.5 g对羟基苯甲酸甲酯（p-hydroxymethylbenzoate），以及30 g蔗糖。将水和琼脂进行高压灭菌，另将对羟基苯甲酸甲酯与蔗糖和果汁一起煮沸。混合琼脂液与果汁溶液后迅速倒入60 mm培养皿中，并去除气泡。
2. 在收集卵之前，需在新鲜培养皿中用酵母糊（7克面包酵母溶于9 ml水中，4°C保存）喂养果蝇，每天至少更换两次，持续至少两天。到第3天时，一个良好的产卵杯每小时应能产出100-200枚卵。将产卵杯侧放，并在琼脂表面划痕，可显著提高产卵效率。许多胚胎会产在划痕处或其附近。
3. 为收集大量胚胎，可用毛笔轻轻将胚胎从琼脂平板转移至筛篮中。筛篮可用15或50 ml离心管制作：剪去底部，保留足够面积以便在管盖与管口之间夹住一层筛网（70 µm孔径）。用dH₂O冲洗胚胎后，将其放入含50%至100%次氯酸钠的新鲜漂白液的培养皿中，以去除外层卵壳（chorion）。或者，也可使用精细镊子逐个收集卵，并手动将其放入一滴漂白液中进行去壳处理。去壳时间通常为30秒至2分钟（新鲜漂白液作用更快），并在解剖显微镜下密切观察。去除卵壳后会暴露出光亮透明的卵黄膜（vitelline membrane）。去壳后的卵应迅速用生理盐水短暂冲洗或直接置于生理盐水中，因为漂白液会快速破坏去卵黄膜后的组织。
4. 准确判定胚胎的发育阶段至关重要。虽然存在标准的Drosophila胚胎发育分期（1-17期；Campos-Ortega 和 Hartenstein, 1985），但由于所有功能性神经肌肉发育均发生在晚期16期或17期，因此这些分期并不实用。因此，通常以25°C恒温高湿培养箱中受精后或更常见的是产卵后（AEL）的时间（小时）来确定胚胎发育阶段。在此条件下，胚胎发育总时长约为21 ± 1小时（25°C）。
5. 通过定时产卵（1-2小时）获得适当发育龄的卵后，需进一步通过形态学标准进行观察。在用dH₂O充分清洗后，将去壳的卵置于塑料培养皿中的dH₂O液滴下进行观察。可通过解剖显微镜下反射光观察形态学特征，确认胚胎发育阶段（Campos-Ortega 和 Hartenstein, 1985）。接近孵化的成熟晚期胚胎（22-24小时AEL）通常可通过表皮分节和气管充气等特征识别。此外，也可利用GFP平衡染色体结合配备适当滤光片的荧光解剖显微镜对胚胎进行基因型鉴定。
6. 进行解剖时，将已去壳且发育阶段明确的胚胎固定在盖玻片上（背面向上），置于一滴生理盐水中（见步骤1.5）。使用玻璃微移液管或钨针在胚胎前端或后端附近刺破卵黄膜，从而将胚胎从膜中释放出来。为便于解剖，应将胚胎背面向上固定于盖玻片上（背面向上的解剖方式可暴露腹侧神经系统和神经肌肉系统以供实验使用。当然，也可根据需要采用其他方向固定胚胎，以便获取其他组织）。
7. 早期胚胎（<16小时AEL）可直接附着于洁净玻璃表面，或经多聚赖氨酸（poly-L-lysine hydrobromide；Broadie 和 Bate, 1993a, b）包被的玻璃表面。而较老的胚胎（>16小时AEL），在形成表皮后必须使用胶水固定，理想情况下应固定于涂有Sylgard（Dow Corning）的盖玻片上。所用胶水为遇水聚合的氰基丙烯酸酯外科或兽用胶（Broadie 和 Bate, 1993c, d）。胶水通过连接橡胶管的小型玻璃电极移液管（内径10-20微米）输送，并通过口控压力调节胶水流速。输送胶水时需格外小心，因为胶水一旦接触生理盐水即迅速聚合。还需注意，若生理盐水中缺乏或仅有极低浓度的二价离子，则无法进行胶合，因为胶水聚合依赖于二价离子。首先使用少量胶水牢固固定胚胎的头部和尾部。
8. 当胚胎两端被胶固定于盖玻片后，使用玻璃电极或磨尖的钨针沿背侧中线做一纵切口。可在正式切割前先轻轻穿刺切口线，以简化操作。随后用更多胶水将切口两侧固定于盖玻片上，使胚胎被轻柔地展平。接着使用连接橡胶管的玻璃移液管通过负压吸除内部器官，包括肠道、脂肪体以及可选的气管（Broadie 和 Bate, 1993a-c）。此时胚胎应平整地附着于盖玻片上，表皮朝下，腹侧中枢神经系统、外周神经及体壁肌肉完全暴露，可供后续实验操作。

讨论

由于胚胎功能特性的成熟过程在短短数小时内迅速进行，因此精确的胚胎分期至关重要。然而，这一分期过程受到多个因素的复杂影响。首先，大多数研究人员采用定时产卵法来确定胚胎发育阶段，但不同条件下个体间的产卵时间可能存在极大差异（Broadie 等，1992）。特别是，饮食受限的雌性个体往往会在产卵前长时间滞留已受精的卵。因此，在收集卵子前，必须通过提供富含酵母的食物喂养雌性至少两天以“清除”其体内滞留的卵（Broadie 等，1992）。此外，年长的雌性个体在产卵前也会更长时间地保留卵子。年长雌性通常仅在卵孵化前几小时才产卵。因此，为了获得最一致的产卵时间，应使用年轻的雌性个体（<7 天龄）（Broadie 等，1992）。其次，在胚胎发育的晚期阶段，仅依靠形态学标准进行分期较为困难。大多数明确的分期特征在 <16 小时 AEL 时已基本完成（Campos-Ortega 和 Hartenstein，1985），而大多数功能性发育则发生在 >16 小时 AEL 之后。晚期发育特征（例如气管充气、表皮鞣化）较少，且在时间上的限制性较弱。基于上述原因，我们建议采用组合方法：通过 1–2 小时的定时产卵收集卵子，根据持续时间 <...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胚胎收集笼	Genesee Scientific	59-100（适用于60 mm培养皿；也可提供其他尺寸）	也可使用打孔的三口烧杯自制收集笼，视频中已展示
Sylgard 184	Dow Corning	可从多家公司获得	手术胶在涂有Sylgard的盖玻片上黏附效果更佳
细玻璃管，外径1.0–1.5 mm	Various		用于拉制精细玻璃针以进行解剖，以及制作胶水输送用的细管
塑料管，用于连接玻璃移液管以进行口吸和施加胶水	Tygon		塑料管内径需与玻璃管外径匹配