本文介绍了一种在聚丙烯酰胺凝胶中使用考马斯亮蓝（CBB）G-250对蛋白质进行染色的简短方案，该方法无需使用有机溶剂或乙酸，而传统CBB染色步骤中通常需要这些试剂。
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本文内容
摘要
摘要
在传统的考马斯亮蓝（CBB）蛋白染色方案中，SDS-PAGE 电泳后的凝胶需使用含有高浓度有毒且易燃有机溶剂（甲醇、乙醇或2-丙醇）和乙酸的溶液进行蛋白的固定、染色和脱色。为加快染色过程，常采用微波炉短时间加热染色液的方法，但这通常会导致有毒或有害的甲醇、乙醇或2-丙醇挥发，并在实验室内产生强烈的乙酸气味，出于安全考虑应避免此类情况。E.M. Wondrak 在两项专利申请（US2001046709 (A1)，US6319720 (B1)）中首次公布了一种替代性染色液配方，其中不使用任何有机溶剂或酸。该方法将 CBB 溶解于重蒸水中（每升含 60–80 mg CBB G-250），并仅添加 35 mM HCl 作为染色液中的唯一其他成分。在 SDS-PAGE 电泳后，凝胶经重蒸水充分洗涤，再进行 CBB 染色。在洗涤和染色步骤中对凝胶加热，可显著缩短处理时间，且无有毒或有害化合物挥发。加热后仅 1 分钟内即可观察到蛋白染色，15–30 分钟后染色完全，背景呈轻微蓝色，通过延长凝胶在重蒸水中的洗涤时间可完全脱除背景染色，而不影响已染色的蛋白条带。
方案
第1部分：考马斯亮蓝染色液的配制
- 将60-80 mg考马斯亮蓝G-250溶于1升双蒸水中，搅拌2-4小时。最后，在深蓝色溶液中加入3 ml浓盐酸，继续搅拌1分钟，并将溶液避光保存以备后续使用。该溶液可保存数周至数月，染色效率不会下降。
- 浓盐酸应按照常规操作规范处理，并在通风橱中使用。最终溶液pH值约为2，因此应佩戴手套，避免与皮肤接触。
第二部分：SDS-PAGE
- 将适量的蛋白质样品与上样缓冲液混合，使终浓度为1×上样缓冲液。我们使用的2×上样缓冲液包含125 mM Tris/H3PO4（25°C时pH 7.5）、2 mM EDTA、4% SDS、200 mM DTT、0.02%溴酚蓝和50%甘油。也可使用其他适用于SDS-PAGE的上样缓冲液。
- 上样前将蛋白质样品加热约5分钟。同时准备凝胶电泳装置。我们使用XCell SureLock® Mini-Cell（Invitrogen）中的预制4–12% NuPAGE© Bis-Tris凝胶（Invitrogen），以MES缓冲液作为电泳缓冲液，但也可使用其他任何凝胶和电泳系统。
- 将蛋白质样品上样至凝胶，并在220 V电压下电泳运行50分钟。
第3部分：凝胶染色
- 拆卸凝胶盒，将凝胶放入容器中，用于后续洗涤步骤。
- 向凝胶中加入约 100 ml 双蒸水，在微波炉中加热 30 秒，加热过程中应在沸腾前停止。将装有凝胶的容器置于摇床振荡 3–5 分钟，并用新鲜水重复此洗涤步骤两次。
- 加入足量考马斯亮蓝（CBB）染色液以覆盖凝胶，并将容器在微波炉中加热 10 秒（避免沸腾）。随后将容器置于摇床上完成染色。通常在 1 分钟后即可观察到蛋白质条带，15–30 分钟后染色强度在大多数情况下已足够明显。
- 倒去染色液，加入 50–100 ml 双蒸水，在摇床上进一步脱色以降低凝胶的浅蓝色背景。如需进一步脱色，可更换为新鲜水。
- 凝胶可进行扫描、拍照或干燥处理，以便长期保存。
第4部分：代表性结果：
按照所述步骤操作后，参见图1中染色良好的凝胶。
参见图2，该凝胶在染色前未经过足够时间的洗涤，残留的SDS抑制了有效的染色。请注意，Marker泳道（*）中含有相同量的Marker蛋白。
图 1： 蛋白质纯化样品上样后染色的代表性凝胶（*：分子量标记）。
图2： 考马斯亮蓝染色前未充分洗涤的凝胶。蛋白质条带较弱（注意：标记物泳道 * 中的蛋白质量与图1相同）。
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讨论
- 洗涤步骤对于蛋白质的高效染色至关重要。若洗涤时间少于2分钟，或洗涤用水体积不足（<50 ml），可能导致蛋白质条带呈浅蓝色，这很可能是因为凝胶中残留了较多的SDS。
- 若后续需对蛋白质进行质谱分析，则应避免使用微波炉加热步骤，同时将每步凝胶洗涤时间延长至约10分钟，并延长染色时间直至条带强度足够。加热会导致蛋白质与凝胶基质发生交联，从而可能影响质谱对蛋白质的检测。
- 除CBB G-250外，也可根据Wondrak的原始方案使用CBB R-250。我们未对这两种染料进行直接比较，因实验室已有CBB G-250的库存，且使用该染料获得了良好的结果。
- 本方案操作快速，且在洗涤与染色步骤中无需使用有毒或有害溶剂，这是采用该方法最为重要且具有说服力的优势。其灵敏度与传统的CBB染色方法及市售CBB染色液相当，在我们进行重组蛋白表达与纯化的SDS-PAGE分析中，灵敏度并未成为限制因素。
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披露
无利益冲突。上述方法最初由 E.M. Wondrak 在专利申请中发表（参见参考文献）。
致谢
我们感谢 Ines Racké 提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 考马斯亮蓝 G-250 | AppliChem | A3480 | 也可使用其他品牌的考马斯亮蓝 G-250 |
| 浓盐酸 |
参考文献
- Process for fast visualization of protein. US patent. , 6319720 (B1) (2001).
- Solution for fast visualization of protein. US patent. , 2001046709 (A1) (2001).
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重印与许可
