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一个 体外 使用EpiDerm重建人表皮（RHE）模型进行皮肤刺激试验（SIT）

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DOI：

10.3791/1366

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2009年7月13日

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1MatTek Corporation

本文内容

摘要

在本视频中，我们演示了为 体外 化学品的皮肤刺激性测试，包括化妆品和药品成分

摘要

EpiDerm 皮肤刺激性试验（EpiDerm SIT）的开发旨在(1,2,3)并经过验证(4,5)为in vitro化学品的皮肤刺激性测试，包括化妆品和药品成分。EpiDerm SIT 利用 3Din vitro重建人表皮（RHE）模型EpiDerm。本方案中所述的操作步骤可用于区分GHS第2类刺激物与非刺激物。(6). 该测试在4天内完成，包括预孵育、60分钟暴露、42小时后孵育以及MTT活力检测。组织接收后，在第0天进行过夜预孵育，随后在第1天将测试化学品直接施用于组织表面。测试化学品可以是液体、半固体、固体或蜡状物。每种测试化学品、阳性对照（5% 水性SDS溶液）和阴性对照（DPBS）均使用三个组织。化学物质暴露持续60分钟，其中35分钟将组织置于37°C的培养箱中。随后通过充分的洗涤程序从组织表面去除测试物质。将组织插入物吸干并转移至新鲜培养基中。经过24小时的孵育（第2天）后更换培养基。更换下的培养基可保存用于后续细胞因子或其他感兴趣终点指标的分析。培养基更换后，组织继续孵育18小时。在整个42小时后孵育期结束时（第3天），将组织转移至黄色MTT溶液中，并孵育3小时。主要由线粒体代谢产生的紫色-蓝色甲臜盐，使用异丙醇提取2小时。采用分光光度计测定提取的甲臜的光密度。若测试化学品处理组组织的活力相对于阴性对照组降低至50%以下，则该化学品被分类为刺激物。该方法可完全替代体内兔皮肤刺激试验，用于化学品的危害识别和标签分类，符合欧盟法规要求。(7).

方案

一、组织预处理——第0天

  1. 收到 EpiDerm EPI-200-SIT 试剂盒后，检查所有组件是否完好无损（试剂盒详细信息见“特定试剂与设备”表格）。
  2. 每三个 EpiDerm 组织，准备一个已预先加入 0.9 mL 检测培养基的无菌 6 孔板。
  3. 在无菌条件下，打开装有 EpiDerm 组织的 24 孔板的塑料袋，并移除无菌纱布。
  4. 使用无菌镊子取出每个含有 EpiDerm 组织的插入物，并将其放入空的 24 孔板中。在此步骤中，通过在无菌滤纸上轻轻吸拭，去除附着在插入物外侧的残留运输用琼脂糖。
  5. 在接下来的 5 分钟内，对组织进行肉眼检查。不得使用有缺陷的组织或表面完全被液体覆盖的组织。
  6. 使用无菌棉签，小心地擦干组织表面。尽量避免直接接触组织——毛细作用足以去除组织表面的水分。
  7. 干燥组织表面后，将三个组织转移至已预先加入 0.9 mL 检测培养基的 6 孔板的上排孔中。释放插入物下方可能被困住的气泡。
  8. 将含有插入物的 6 孔板放入培养箱中，在 37 ± 1°C、5 ± 1% CO2、95% 相对湿度（RH）条件下预孵育 60 ± 5 分钟。
  9. 在 60 ± 5 分钟预孵育结束后，将插入物从 6 孔板的上排孔转移至下排孔中。将板重新放回培养箱（37 ± 1°C，5 ± 1% CO2，95% RH）进行过夜预孵育（18 ± 3 小时）。
  10. 将剩余的检测培养基放入冰箱（5 ± 3 °C）中。在过夜预孵育结束后，即可向 EpiDerm 组织施加待测化学品。

    注：若组织送达时间较晚（例如，组织在周三而非周二到达），可适当缩短预孵育程序。

II. 化学暴露 - 第1天

  1. 为每种待测化学物质准备一块6孔板，仅在上排各孔中加入0.9 ml的检测培养基。
  2. 在计划进行化学物质暴露前约5分钟，从培养箱中取出含有预孵育组织的6孔板。
  3. 评估组织表面，并使用无菌棉签去除任何水分。
  4. 用待测物质的代码或名称标记所有6孔板盖。
  5. 以1分钟间隔对组织施加待测化学物质，以便在暴露后便于冲洗。将已施加化学物质的板置于无菌操作台中，直至最后一个组织完成施加。
  6. 测试液态化学物质时，直接将30 μL溶液滴加至组织表面，并将尼龙网置于组织表面。如有必要，使用带橡胶头的玻璃巴斯德移液管轻轻调整网的位置。切勿按压组织表面。
  7. 测试半固体物质时，使用正向置换移液器将30 μL样品直接滴加至组织表面。如有必要，用巴斯德移液管轻轻涂抹，尽可能覆盖整个组织表面。
  8. 测试固体材料时，在施加待测物质前短暂用25 μL无菌DPBS润湿组织表面，以改善组织与待测化学物质的接触。用25 mg校准的尖头施用勺（或其他合适工具）取约25 mg精细研磨的待测样品，将其施加至组织表面。如有必要，使用带橡胶头的巴斯德移液管完全清空勺中内容物。轻轻晃动插入物，以促进固体在表面的扩散。
  9. 对于蜡状物质，尝试将其制成直径约8 mm的扁平“饼干状”片剂，并放置于先前用无菌DPBS润湿的组织表面。为改善待测物质与组织之间的接触，可用不锈钢或塑料辅助物压住“饼干”。
  10. 对对照组组织分别施加DPBS作为阴性对照，5% SDS作为阳性对照。
  11. 最后一个组织施加完成后，将所有板转移至加湿培养箱中（37 ± 1°C，5 ± 1% CO2，95% RH），孵育35 ± 1分钟。
  12. 在37°C孵育35 ± 1分钟后，从培养箱中取出所有板，放入无菌操作台中，等待第一个施加组织的总暴露时间达到60分钟。
  13. 随后开始清洗程序，按每分钟处理一个插入物的时间间隔进行（以确保每个插入物的总暴露时间为60分钟）。
  14. 使用冲洗瓶用无菌DPBS冲洗组织。用持续的DPBS流反复填充组织插入物15次并排空（注：对于带有尼龙网的组织，先冲洗组织表面5次，然后用尖头镊子小心移除尼龙网，之后继续完成剩余10次冲洗）。
  15. 使用冲洗瓶完成第15次冲洗后，将插入物完全浸入150 ml DPBS中3次，并晃动以去除残留的待测物质。
  16. 最后，分别从内部和外部各用无菌DPBS冲洗组织插入物一次。
  17. 通过轻轻晃动插入物并在无菌吸水纸上轻压，去除组织表面多余的DPBS。
  18. 将吸干后的组织插入物转移至预先加入检测培养基的新6孔板中。上述所有步骤（14–18）必须在每1分钟内完成一个插入物。
  19. 最后一个组织冲洗完成后，用无菌棉签小心擦干每个组织的表面。
  20. 将组织在培养箱中继续孵育24 ± 2小时（37 ± 1°C，5 ± 1% CO2，95% RH）。

    注：每位检测技术人员在单次检测运行（批次）中不应测试超过6种待测物质（包括阴性和阳性对照），以便能够按照下述方案操作

III. 培养基更换 - 第2天

  1. 在 24 ± 2 小时的孵育后，将插入物转移至已预先加入 0.9 ml 培养基的 6 孔板下室中。可收集上排孔中的培养基用于其他终点指标（如细胞因子、趋化因子等）的分析。对次要终点指标的分析为可选步骤。
  2. 继续孵育（37 ± 1°C，5 ± 1% CO2，95% 相对湿度）18 ± 3 小时。

IV. MTT 细胞活力检测 - 第3天

  1. 用化学物质名称或代码标记两个24孔板。一个板用于组织与MTT共孵育，另一个板用于提取步骤。
  2. 通过解冻MTT浓缩液（5 mg/ml）并用MTT稀释液稀释来配制MTT溶液。MTT溶液的终浓度为1 mg/ml。
  3. 向24孔板的每个孔中加入300 μL MTT溶液。
  4. 从培养箱中取出6孔板，将插入物底部在吸水纸上轻压吸干，然后将其转移至预先加入MTT溶液的24孔板中。
  5. 将24孔板放入培养箱（37 ± 1°C，5 ± 1% CO2，95% 相对湿度）中孵育3小时 ± 5分钟。必须严格遵守3小时 ± 5分钟的孵育时间，以避免不同MTT读数之间的偏差。
  6. MTT孵育完成后，使用抽吸泵轻轻吸除所有孔中的MTT培养基。
  7. 用DPBS重新填充各孔，再次吸除。重复此洗涤步骤两次，并确保最后一次吸除后组织干燥。
  8. 洗涤完成后，将插入物转移至新的24孔板中。通过移液枪轻轻向每个插入物中加入2 mL提取剂溶液（异丙醇），使液面上升至插入物上缘以上，从而完全浸没组织。
  9. 密封24孔板（例如使用Parafilm或密封袋），以防止提取剂蒸发。在室温下于平板摇床（约120 rpm）上轻轻振荡至少2小时，从组织中提取MTT。也可采用不振荡的过夜提取方式。
  10. 提取完成后，用注射针头或带乳胶头的巴斯德移液管刺穿插入物，使提取液流入原来取出插入物的孔中。
  11. 丢弃穿孔后的插入物，并将孔中溶液上下吹打三次，直至均匀。
  12. 对于每份组织，取200 μL紫色甲臜溶液两份，转移至96孔平底微孔板中。根据本视频协议附带的电子表格中规定的固定板设计进行重复加样。空白对照使用异丙醇。
  13. 使用波长570 nm（540–580 nm）在96孔板分光光度计中测定MTT提取物的光密度（OD），无需参考滤光片。
  14. 将结果输入电子表格，以自动计算最终结果（图1）。
  15. 若通过MTT法测定的组织活力百分比相对于阴性对照<50%，则该测试化学品被判定为“刺激性”（R38或GHS类别2）。


    注意：MTT具有毒性，操作时务必佩戴防护手套。MTT及其溶液需避光保存，因其对光敏感。MTT溶液应在配制后数小时内使用，因其会随时间降解。

V. 检测质量控制



  • EpiDerm EPI-200-SIT 试剂盒验收标准：

    体外 重建人表皮（RHE）模型应能在长时间内提供一致且高质量的数据，而不仅限于验证过程期间(8)。为确保长期检测的可重复性与性能，建议遵循以下指南：“对细胞或组织进行全面表征，对每一批次取样以评估其性能，并定期使用对照和基准化学品，以确保检测性能的一致性”(9)。除下述检测验收标准外，生产商还会使用另一种基准化学品（1% Triton X-100）对每一批 EpiDerm 产品进行质量控制测试。测试中测定使组织活力降至50%所需的暴露时间（ET-50）。对于 EpiDerm，自1996年以来，每年的平均 ET-50 值介于5.9小时至7.5小时之间。自1996年以来，阴性对照组织的批间变异系数（CV）每年平均低于7.5%。每一批产品的 ET50 值必须落在1996年建立的历史平均 Triton X-100 ET50 值的2个标准差范围内（即 ET-50 = 6.7 小时；下限接受值 = 4.8 小时；上限接受值 = 8.7 小时），方可由生产商放行使用。
  • EPI-200-SIT 检测验收标准1：阴性对照

    在 MTT 检测中，阴性对照（NC）组织（经无菌 DPBS 处理）的绝对光密度（OD）值反映了检测实验室在运输、储存及特定使用条件下所获得的组织活力水平。若 NC 组织的平均 OD570 值 ≥1.0 且 ≤2.5，则该检测符合验收标准。
  • EPI-200-SIT 检测验收标准2：阳性对照

    使用5% SDS（溶于 H2O）溶液作为阳性对照（PC），并与待测化学品同时进行测试。“同时”意味着每次检测均需包含 PC，但每个检测日仅需一个 PC。阳性对照的活力应处于历史数据的95%置信区间内。若以阴性对照组织为基准，PC 组织的平均活力百分比为20%，则该检测符合验收标准。
  • EPI-200-SIT 检测验收标准3：标准差（SD）

    皮肤刺激性根据3个独立组织的平均活力进行预测，因此组织重复样本间的变异性应处于可接受的低水平。若3个相同处理的重复样本中，各组织活力百分比计算所得的标准差 <18%，则该检测符合验收标准。

代表性结果

体外实验数据表，EpiDerm SIT，平均光密度，存活率百分比，测试分类。
相对存活率百分比柱状图；统计数据分析结果；实验比较。
存活率检测结果表；样品编号、原始数据、校正后数据、平均值及存活率百分比。
图1. 6种测试样品、阴性对照（NC）和阳性对照（PC）的结果——用于结果计算的自动化电子表格部分。与阴性对照相比，使组织存活率降低至50%以下的测试化学品被归类为刺激物。本实验经过优化，所得结果与分类阈值（50%存活率）有足够差距，从而提高了检测的稳健性。

EpiDerm SIT 和 MTT 检测试剂盒组分、储存条件及使用详情表格。

讨论

在本视频中，我们展示了已开发并验证的EpiDerm皮肤刺激试验（EpiDerm SIT） 体外 化学品的皮肤刺激性测试，包括化妆品和药品成分的测试。进行该方法时，必须在无菌条件下操作，并严格遵循已验证的实验方案，因为对方案的任何偏离都可能导致不同的结果。虽然该检测方法可进行某些修改，但对方案的任何变更均应直接与作者讨论。

该方法唯一的局限性在于测试物质可能对 MTT 检测终点产生干扰。若测试物质本身有颜色，或可直接还原 MTT（从而模拟细胞线粒体的脱氢酶活性），则可能干扰 MTT 检测终点。然而，仅当 MTT 检测时（即暴露于测试物质后 42 小时）仍有足量的测试物质残留在组织表面或内部时，此类测试物质才会构成问题。若发生这种不太可能的情况，可通过 MatTek Corp. 提供的检测标准操作规程中详细描述的程序，分别定量真实的代谢性 MTT 还原以及有色测试材料的吸光贡献或测试材料引起的虚假直接 MTT 还原。

披露

作者为 MatTek 公司的雇员，该公司生产本文所用的试剂和工具。

致谢

作者谨感谢德国联邦风险评估研究所（BfR）的ZEBET、德国巴斯夫股份公司（BASF SE）、美国体外科学研究所（IIVS Inc.）、奥地利Zet-LSL参与改良型EpiDerm SIT的多中心国际验证研究(5)。

参考文献

  1. Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. ngrid, Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests. ALTEX. 21, 107-114 (2004).
  2. Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test. ATLA. 33, 351-367 (2005).
  3. Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication. ATLA. , Forthcoming (2009).
  4. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H. The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA. 35, 559-601 (2007).
  5. Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances. Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Schäfer, M. R., Schäfer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kandárová, H. 15th Congress on Alternatives to Animal Experimentation, 2008 September 19-21, Linz Austria, , (2008).
  6. United Nations. Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS). , Second revised edition, UN. New York and Geneva. (2007).
  7. ESAC. Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing. , ESAC. (2008).
  8. Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers. Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).
  9. Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice. Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).

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EpiDerm SIT MTT DPBS 5 SDS OD

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