我们提出一种用于光学投影断层成像的玻恩归一化方法（BnOPT），该方法考虑了成像样本的吸收特性，以获得准确且定量的荧光断层重建结果。我们使用所提出的算法重建小动物器官内荧光分子探针的分布。
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本文内容
摘要
摘要
光学投影断层成像是近年来引入的一种三维成像技术，主要用作发育生物学和基因表达研究中的成像工具。该技术首先将生物样本经梯度乙醇溶液脱水，然后置于苯甲醇与苯甲酸苄酯按2:1比例配制的混合液（BABB或Murray's Clear溶液）中透明处理，从而使样本在光学上变得透明。经过透明处理后，样本中的散射贡献可大幅降低并几乎可忽略不计，而吸收贡献则无法完全消除。在尝试重建待测样本内部荧光分布时，这种吸收效应会影响重建结果，不可避免地导致图像伪影和定量误差。尽管通过在透明介质中持续数周甚至数月可进一步降低吸收，但这将导致荧光信号逐渐丢失，并使样本处理时间变得不切实际地延长。此问题在重建外源性对比剂（分子对比剂）以及内源性对比信号（例如基因表达的荧光蛋白的重建）时均存在。
方案
成像步骤
实验装置的详细情况如图1所示。光源LS既用作吸收测量的照明光源，也用作荧光测量的激发光源，并通过窄带通干涉滤光片BPF进行滤光。一组固定的和可变的中性密度滤光片ND，结合自动快门S的使用，可控制照射到样品上的光量，并使其保持足够低的水平，以防止任何光漂白现象的发生。通过使用由两个透镜组成的伽利略望远镜结构的扩束器BE以及一个漫射器，实现样品的均匀照明。样品S浸没在透明溶液中，并固定在样品 holder 上，通过高速旋转台（Newport, PR50）绕其垂直轴旋转，旋转台的绝对精度为0.05度。三个独立的手动控制器可用于调节样品垂直轴在其正交平面内的倾斜角度并进行调整。透射照明信号由CCD相机直接检测；荧光信号则先经过窄带通干涉滤光片与长通滤光片（Omega Optical, Brattleboro, VT）组合过滤，然后通过远心镜头TL收集。远心镜头具有独特的优势，使其成为光学投影断层成像的理想选择。实际上，由于镜头组件内部在焦平面位置设有孔径光阑，确保形成光阑像的光线与光轴平行传播，从而几乎完全消除了透视畸变，并在远心深度范围内的多个成像平面提供一致的放大倍率。
样品制备
为固定组织/器官，需遵循以下步骤
- 样品在4°C条件下用PFA固定8小时。
- 然后用PBS洗涤样品15分钟。
- 将样品包埋于0.8%琼脂糖块中。
- 通过20%至100%的乙醇溶液梯度对琼脂糖块进行脱水。该梯度乙醇脱水程序有助于避免样品发生不对称收缩。
- 最后，将样品在100%乙醇中孵育10小时，以彻底去除样品中的水分。
- 将样品置于苯甲醇与苯甲酸苄酯按1:2比例配制的溶液中，直至样品透明所需时间为准。注意，不同样品所需时间差异较大，可能从数小时到数天不等。
- 透明过程结束后，样品中若残留微量乙醇，可能因透明液中酒精的热运动而导致重建图像出现严重伪影。为避免此问题，建议进行第二次透明循环。
- 步骤4和5应在避光条件下进行，以防止荧光对比剂或荧光蛋白发生光漂白。
心脏样本制备
在对任何组织进行成像之前，必须去除其中的血液成分，以避免重建结果中出现高吸收伪影。可按照以下步骤操作。
- 通过腹腔注射（IP）给予小鼠氯胺酮（90 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物进行麻醉。
注意：“从此步骤开始，始终避免样品暴露于光线下。” - 注射肝素50 U（IP），5分钟后进行纵向剖腹手术。
- 切开左肾静脉（LRV），并向下腔静脉（IVC）灌注20 ml生理盐水溶液。
- 琼脂糖块应依次在20%、40%、60%和80%乙醇中各孵育1小时进行脱水，最后在100%乙醇中孵育10小时（过夜）。
- 随后按照常规样品制备流程固定心脏
注意：“从此步骤开始，始终避免样品暴露于光线下。”
吸收重建
在无散射情况下，光学吸收的重建通常类似于X射线计算机断层扫描（X-CT），可采用常见的滤波拉东反投影算法实现。吸收图像通过CCD相机在透射照明模式下获取，沿垂直轴以1度为间隔采集360个投影。将样品的垂直轴与CCD像素列对齐较为方便。
- 将琼脂糖块放入盛有透明溶液的腔室中
- 使用准直光束照射样本，进行激发和透射测量
- 以1度为间隔，将样本旋转360次投影
- 在吸收（本征）和荧光波长下，通过透射照明采集图像
- 放置快门以避免持续照射，减少光漂白
- 采用滤波拉东反投影算法对样本进行断层重建
荧光重建
用于吸收重建的算法不适用于荧光分布的重建，若不考虑吸收贡献，将导致严重的伪影。
- 按照“吸收重建”部分的说明进行操作。
- 同时采集吸收和荧光测量数据
- 将数据合并为归一化Born场图像
- 写出内源性和荧光波长下光传播前向模型的方程。
- 在离散化网格上计算前向模型格林函数的权重矩阵
- 对权重矩阵求逆，并将其乘以检测到的归一化Born场图像，以获得物体内荧光分布的重建结果
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致谢
C. Vinegoni 感谢美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 1-RO1-EB006432 的支持。
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参考文献
- Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sorensen, J., Baldock, R., Davidson, D. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-544 (2002).
- Lee, K., Avondo, J., Morrison, H., Blot, L., Stark, M., Sharpe, J., Bangham, A., Coen, E. Visualizing plant development and gene in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18, 2145-2156 (2006).
- Oldham, M., Sakhalkar, H., Wang, Y. M., Guo, P. Y., Oliver, T., Bentley, R., Vujaskovic, Z., Dewhirst, M. Three-dimensional imaging of whole rodent organs using optical computed and emission tomography. J. Biomed. Opt. 12, 1-10 (2007).
- Ntziachristos, V., Weissleder, R. Experimental three-dimensional fluorescence reconstruction of diffuse media by use of a normalized Born approximation. Opt. Lett. 26, 893-895 (2001).
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