本研究描述了一种改良的氯化铯方法，可轻松从感染猫的粪便中纯化出适用于分子生物学和组织培养操作的刚地弓形虫卵囊
本文内容
摘要
摘要
Toxoplasma gondii是一种专性细胞内寄生的原生动物病原体，常见于人类感染。它是一种特征明确的顶复门原虫，与食源性和水源性疾病暴发密切相关。其终末宿主为猫科动物，在其中进行有性繁殖，产生高度传染性且环境抗性强的卵囊。感染途径包括摄入被污染肉类中的组织囊肿，或来自土壤或水体中的卵囊。健康个体感染后通常无症状，但会形成终生潜伏感染，当个体免疫功能受损时可发生再激活，导致弓形虫脑炎甚至死亡。被污染的肉类中含有的T. gondii囊肿一直是欧洲和美国感染的主要来源，但近年来动物管理和饲养实践的改进以及食品处理和加工程序的提升已显著降低了其流行率T. gondii肉中的包囊1, 2然而，人类的血清流行率仍然相对较高，表明接触被卵囊污染的土壤或水源可能是主要原因。事实上，全球已报道多起水源性弓形虫病暴发事件，支持了环境中的卵囊形式暴露具有重大健康风险的理论。3-5. 迄今为止，关于了解流行率的研究T. gondii由于缺乏在环境中检测卵囊的工具，对水中和环境中卵囊的研究仍然有限5, 6。这主要是由于缺乏高效的纯化方案，无法获得大量高纯度的T gondii用于研究目的的感染猫体内的卵囊。本研究描述了一种改良的CsCl方法的建立，该方法可简便地纯化T. gondii从感染猫的粪便中分离出的卵囊，适用于分子生物学和组织培养操作7.
方案
1. 处理T. gondii卵囊时的一般安全预防措施
- 处理T. gondii卵囊时，必须遵守所有安全预防措施。在大多数健康个体中，T. gondii感染可被免疫系统有效控制；然而，感染将转为终身潜伏状态。免疫功能低下者对弓形虫病尤为易感，不应接触T. gondii卵囊。孕妇也不应接触T. gondii卵囊，因为感染可能导致严重的出生缺陷8。
- T. gondii卵囊只能在指定区域由经过培训的人员操作。必须在指定区域张贴标识，提示正在进行T. gondii卵囊相关工作，以提醒进入该区域的人员。
- 处理T. gondii卵囊时，应穿戴适当的个人防护装备（PPE），例如实验服、一次性防护服、一次性手套，以及适当的眼部防护装置或面罩。
- 建议频繁更换手套。不得使用被T. gondii卵囊污染的手套操作任何实验设备。
- 处理T. gondii卵囊时，应始终使用金属可高压灭菌托盘，并铺有一次性吸水衬垫。确保所使用的所有架子、试管等器材均为一次性或可高压灭菌。
- 所有含T. gondii的废弃物必须经过两次高压灭菌，每次至少持续一小时。
- 所有非一次性设备（如架子、托盘等）也必须经过两次高压灭菌，每次至少持续一小时。
- 用于吸取液体的真空管路应连接Vacushield™过滤器，以防止真空泵被污染。
- 完成T. gondii卵囊操作后，所有受影响的实验台面必须进行消毒。应大量喷洒新配制的10%次氯酸钠溶液至工作区域，并使其自然干燥，随后必须用清水充分冲洗该区域。
2. 缓冲液和溶液的配制
- 通过将 752.66 g 蔗糖溶解于 600 ml ddH2O 中，配制 1 L 的 2.2 M 蔗糖溶液。使用加热磁力搅拌器搅拌并温和加热以溶解蔗糖。待完全溶解后，用 ddH2O 定容至 1 L。随后需通过高压灭菌至少 20 分钟进行灭菌处理。
- 通过将 6.05 g Tris-HCl 和 3.7 g EDTA 加入 700 ml ddH2O 中，配制 1 L TE 缓冲液（50 mM Tris-HCl，10 mM EDTA），调节 pH 至 7.2，然后用 ddH2O 定容至 1 L。
- 对于 CsCl 梯度，通过将 21.75 g CsCl 加入 103.25 ml TE 缓冲液中，配制比重为 1.15 的 CsCl 储存液（1.15-CsCl）。溶液 A：将 30 ml TE 与 20 ml 1.15-CsCl 混合。溶液 B：将 20 ml TE 与 30 ml 1.15-CsCl 及 12.5 μl 酚红溶液混合。溶液 C：将 10 ml TE 与 40 ml 1.15-CsCl 混合（表 1）。
- 通过将 40 g NaOH 溶解于 800 ml ddH2O 中，配制 1 L 的 1 N 氢氧化钠（NaOH）溶液。待溶解后，用 ddH2O 定容至 1 L。
- 通过将 20 ml H2SO4 与 980 ml ddH2O 混合，配制 1 L 的 2%（体积分数）H2SO4 溶液。
3. 蔗糖浮选
- 将10 ml含T. gondii卵囊的粪便悬液（溶于2% H2SO4中）加入50 ml锥形离心管中。需注意，此处的粪便悬液是指已通过先前所述蔗糖漂浮法进行预处理的样本8。当从感染猫只采集粪便样本后，需按参考文献8所述方法进行蔗糖漂浮处理。此额外的蔗糖漂浮步骤对于进一步减少带入CsCl纯化过程的粪便碎片、获得尽可能纯净的T. gondii卵囊至关重要。
- 向粪便悬液中加入6 ml（3/5体积）1 N NaOH，中和2% H2SO4，并通过涡旋充分混匀。
- 向粪便悬液中加入等体积（16 ml）的2.2 M蔗糖溶液，使终浓度为1.1 M，并通过涡旋充分混匀。
- 使用10 ml移液器，小心地将10 ml ddH2O覆盖于蔗糖/粪便悬液上层。于室温下以1,200 × g离心20分钟，不启用刹车。
- 小心吸取上层水相及界面层，并通过从气-水界面处移液的方式转移至新的50 ml锥形离心管中，移液时避免旋转移液器。在收集界面层时，应尽量减少蔗糖的带出。
- 通过涡旋混匀剩余的蔗糖/粪便沉淀物溶液。
- 重复步骤3.4和3.5。
- 用ddH2O将两次获得的卵囊界面层溶液定容至50 ml，于室温下以2,000 × g离心10分钟。
- 吸除每管中的上清液，用5 ml TE缓冲液重悬沉淀物，并将所有卵囊悬液合并。最终合并体积应为10 ml。
4. CsCl 梯度
- 使用50 ml注射器配18号钝头、可高压灭菌的不锈钢针头和双向止流阀，小心地将各层溶液依次铺置于50 ml聚碳酸酯Oak Ridge离心管中，制备不连续的CsCl梯度。注：在溶液B中加入酚红，以便于区分梯度层（表1）。
- 按以下顺序缓慢向离心管中加入下列溶液。应注意流速不得超过0.5 ml/秒。
- 10 ml TE/卵囊悬浮液样品
- 8 ml 溶液A
- 8 ml 溶液B
- 8 ml 溶液C
- 将Oak Ridge离心管在4 °C下以12,000 × g离心60分钟，不启用刹车。可使用固定角转子，但高速水平摆动转子可实现卵囊与悬浮样品更佳的分离效果，并最大限度减少粪便碎片在管壁或管底的拖尾现象。拖尾程度取决于粪便悬浮液的组成，因此若粪便悬浮液极为浑浊，可能需要进行两次CsCl梯度离心。
- 离心后，收集位于溶液A与溶液B之间的不透明/白色卵囊条带。为尽量减少粪便碎片的污染，应直接穿入卵囊条带而不扰动梯度层，并使用10 ml移液管收集卵囊界面层。将卵囊界面层转移至新的50 ml锥形离心管中。在收集卵囊界面层时，应尽量减少吸入的CsCl溶液体积，以免在后续洗涤步骤中影响卵囊的沉淀。
- 用30–40 ml去离子水（ddH2O）洗涤卵囊。在室温下以2,000 × g离心10分钟，不启用刹车。小心吸除上清液，避免扰动卵囊沉淀。重复洗涤共额外两次。
- 最后一次洗涤结束后，小心吸除上清液，将沉淀重悬于10 ml 2%硫酸中，4 °C保存备用。卵囊现已可用于后续操作。可通过显微镜检查样品中是否存在粪便碎片，以评估卵囊纯度。
致谢
我们感谢 Nichole Brinkman 和 Michael Ware 对本文稿的技术审阅，感谢 Abu Sayed 博士和 Linda Ransick 提供的技术与行政支持。美国环境保护局通过其研究与发展办公室，部分资助并参与了本研究所述工作，相关合作基于与 Dynamac 公司签订的合同编号 EP-D-06-096，以及与美国农业部（USDA）签订的跨机构协议编号 DW-12-92289801-0。本研究已通过机构审查并获准发表。提及商品名称或商业产品并不构成对其使用 endorsement 或推荐。MJS 当前地址：Dynamac, Inc.，俄亥俄州辛辛那提市。
参考文献
- Dubey, J. P. Prevalence of viable Toxoplasma gondii in beef, chicken, and pork from retail meat stores in the United States: risk assessment to consumers. J. Parasitol. 91, 1082-1093 (2005).
- Tenter, A. M., Heckeroth, A. R., Weiss, L. M. Toxoplasma gondii: from animals to humans. Int. J. Parasitol. 30, 1217-1258 (2000).
- Bowie, W. R. Outbreak of toxoplasmosis associated with municipal drinking water. Lancet. 350, 173-177 (1997).
- Moura, L. de Waterborne toxoplasmosis, Brazil, from field to gene. Emerg. Infect. Dis. 12, 326-329 (2006).
- Jones, J. L., Dubey, J. P. Waterborne toxoplasmosis - Recent developments. Exp. Parasitol. doi: 10.1016/j.exppara.2009.03.013, (2009).
- Dumetre, A., Darde, M. L. How to detect Toxoplasma gondii oocysts in environmental samples. FEMS Microbiol. Rev. 27, 651-661 (2003).
- Dumetre, A., Darde, M. L. Purification of Toxoplasma gondii oocysts by cesium chloride gradient. J. Microbiol. Methods. 56, 427-4230 (2004).
- Dubey, J. P. Toxoplasmosis of Animals and Man. , 2nd Edition, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL. (2009).
重印与许可
