聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的快速高灵敏度胶体考马斯亮蓝G-250染色法

摘要

本视频将推广一种基于 Kang 方法的胶体考马斯亮蓝 G-250 染色方案 等 用于检测凝胶中平均4 ng的蛋白质。染色在2小时内完成，且无需费力。我们常规采用Kang的方案进行基于凝胶的蛋白质组学分析。

摘要

考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue, CBB）是一种常用于SDS-PAGE分离蛋白质后进行显色的染料，具有操作简便和定量性高的优点。此外，它完全兼容质谱法进行蛋白质鉴定。然而，尽管具备这些优势，CBB的灵敏度被认为低于银染或荧光染色，因此在基于凝胶的分析性蛋白质组学研究中较少用于蛋白质的检测。

为了提高考马斯亮蓝（CBB）染色的灵敏度，研究人员对最初的考马斯亮蓝染色方案¹进行了多项改进。其中两项主要修改通过将染料分子转化为胶体颗粒，增强了对低丰度蛋白质的检测能力：1988年，Neuhoff 及其同事在基于CBB G-250的染色液中加入了20%甲醇和更高浓度的硫酸铵²；2004年，Candiano 等. 建立了Blue Silver染色法，该方法在硫酸铵和甲醇存在下，将CBB G-250与磷酸结合使用³。然而，这些改进方法最多仅能检测到约10 ng的蛋白质。2002年，Kang 等. 发表了一种在科学界未广泛传播的胶体考马斯亮蓝染色方案，他们针对络合物质对Neuhoff的胶体CBB染色法进行了修改：用硫酸铝替代硫酸铵，并以毒性较低的乙醇取代甲醇⁴。Kang研究中提出的新型铝基染色法表现出更高的灵敏度，最低可检测到每条带1 ng的蛋白质（磷酸化酶b），且不同蛋白质之间的灵敏度差异较小。

本文展示了Kang氏快速灵敏胶体考马斯亮蓝染色法在蛋白质分析中的应用。我们将以本课题组常规制备的二维凝胶为例，说明该方法的快速且简便的操作流程。

方案

第一部分：采用杯上样法的二维（2-D）凝胶电泳

1. IPG胶条重水合与等电聚焦（IEF）
   • 使用Immobilin DryStrip重水合托盘，将pH 6-11的Immobilin DryStrip凝胶（7 cm）在125 μl重水合溶液[7 M尿素、2 M硫脲、4% CHAPS、50 mM羟乙基二硫化物和2% IPG缓冲液pH 6-11]中重水合至少10小时。
   • 将沉淀的蛋白质样品溶解于等电聚焦样品缓冲液[7 M尿素、2 M硫脲、2% CHAPS、2% ASB-14、50 mM羟乙基二硫化物和2% IPG缓冲液pH 6-11]中，使每100 μl溶液含60–100 μg蛋白质。
   • 室温下溶解至少30分钟后，通过阳极杯上样法使用上样杯加入蛋白样品。上样杯体积为100 μl（多通道上样杯最多可容纳150 μl）。
     注意：若在聚焦程序开始时加入一个低电压步骤，并在杯中仍有液膜时重新加样，可上样更多样品！
   • 在Multiphor II电泳仪中以梯度模式进行等电聚焦，总电压时间为11.1 kVh。
2. 平衡与SDS-PAGE
   • 等电聚焦完成后，将IPG胶条分别在平衡缓冲液[50 mM Tris-HCl/pH 8.8、6 M尿素、30%甘油和2% SDS]中加入1%二硫苏糖醇（还原）和2.5%碘乙酰胺（烷基化），在摇床上各孵育15分钟。
   • 用H₂

讨论

是创新，还是又一种考马斯亮蓝实验方案？

目前，考马斯亮蓝染色存在多种实验方案。其中大多数方案均源自Neuhoff及其同事提出的一种常用方案的若干小或大范围修改²。Kang的方案也是基于Neuhoff公式的衍生方法。但这种方法是否确实是蛋白质组学研究中一种有效的考马斯亮蓝染色替代方法？我们将从检测灵敏度和实用性两个主要方面进行阐述，以证明该方案相较于其他考马斯亮蓝染色方法，甚至相较于银染和荧光染色，都具有显著优势。

焦点一：检测限

在Kang的研究中，他们检测到了每条带低至1 ng的多种标记蛋白（图2）。但根据我们的观点，每条带4-8 ng的检测限更符合实际操作情况（表1）。他们进一步讨论了与两种方法相关的更高灵敏度：一种是使用含磷酸、硫酸铵和甲醇的胶体考马斯亮蓝G-250（CBB G-250）染色法，另一种是Amersham Pharmacia Biotechnology公司的酸性银染法（Silver Stain Plus Kit）.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Immobiline DryStrip 干胶条	GE Healthcare	17-6001-94	即使超过有效期 2 年仍可使用。
Immobiline DryStrip 再水化托盘	GE Healthcare	80-6371-84	切勿使用有机溶剂清洗。适用于 7–18 cm 的 IPG 胶条。
Immobiline DryStrip 试剂盒	GE Healthcare	18-1004-30	包含托盘、电极架、阳极和阴极电极、对齐装置、加样梳和样品杯。
EPS 3501 XL 电源	GE Healthcare	18-1130-05	可提供最高 3500 V 的电压。
Multiphor II 电泳仪	GE Healthcare	18-1018-06	可移动电极支持所有长度（7–24 cm IPG 胶条）的等电聚焦电泳。
PerfectBlue 双板凝胶系统 Twin S	Peqlab	45-1010-C	用于 10×10 cm 小型凝胶格式的 SDS-PAGE。凝胶槽配有冷却系统。
带盖染色皿	VWR international	216-3412	适用于小型凝胶。可在摇床上堆叠使用。
硫酸铝十八水合物	Merck & Co., Inc.	1.01102.5000	我们使用 Merck 产品效果最佳。仅提供 5 kg 包装。
正磷酸	Prolabo	20 624.295	以玻璃瓶装出售。