快速，灵敏的胶体考马斯亮G - 250染色蛋白聚丙烯酰胺凝胶

Summary

该视频应普及胶体考马斯亮蓝G - 250染色协议，根据康等。

Abstract

考马斯亮蓝（CBB）是常用的SDS - PAGE分离蛋白的可视化，提供一个简单的染色程序和高定量的染料。此外，它是完全兼容与质谱蛋白质鉴定。但尽管有这些优势，CBB被认为是比银或荧光染色法和较不敏感，因此很少用于分析凝胶为基础的蛋白质组学方法检测蛋白质。

已作出了一些改进原来的考马斯^协议 1增加CBB灵敏度。两个重大修改，以提高转换成胶体粒子的染料分子的低丰度蛋白质的检测:在1988年，Neuhoff和他的同事们应用到的CBB ^G - 250基于染色溶液2 20％甲醇和硫酸铵的浓度较高，和2004年Candiano等。建立了蓝银在硫酸铵和^甲醇 3在场的CBB G - 250使用磷酸。然而，所有这些修改，只允许约10毫微克蛋白质的检测。一个广泛琐细的协议，胶体考马斯染色康有为等人在2002年发表了他们关于修改Neuhoff胶体CBB染色协议的络合物质。取而代之的硫酸铵，他们用硫酸铝和甲醇毒性较低的^乙醇 4取代。的新型铝为基础的染色，在康有为的研究中表现出卓越的灵敏度，可检测低为1毫微克/乐队（磷酸二）与灵敏度变化不大，对蛋白质而定。

在这里，我们展示了康有为的快速和敏感的胶体考马斯亮蓝染色分析目的蛋白的协议的应用程序。我们将说明使用二维凝胶经常在我们的工作小组进行快速和容易的协议。

Protocol

第1部分:二维（2 - D）凝胶电泳，用杯装

1. IPG -带补液等电聚焦（IEF）
   • 在125μL补液盐补充水分Immobiline DryStrip凝胶，pH值6-11（7厘米）[7 M尿素，硫脲2米，4％CHAPS，50毫米hydroxyethyldisulfide和2％IPG缓冲液的pH值6-11]采用Immobiline DryStrip Reswelling托盘至少10小时。
   • 在IEF样品缓冲液溶解沉淀蛋白质样品[7 M尿素，硫脲2米，2％CHAPS，2％的ASB - 14，50 mM的hydroxyethyldisulfide和2％IPG缓冲液的pH值6-11]对应60-100微克每100μL蛋白。
   • 增溶（在室温下至少30分钟）后，申请通过阳极使用样品杯的杯装的蛋白质样品。杯的体积为100μL（集成块杯允许多达150μL）。
     注意:您可以负荷较大的样品量，如果你插入一个低电压的一步，在开始聚焦协议和笔芯的杯子，而仍然是一个有在杯子里的液体膜！
   • 进行等电聚焦Multiphor II电泳单位在梯度模式为11.1 KVH。
2. 平衡和SDS - PAGE电泳
   • IEF后，IPG胶条受到还原和烷基化，每次15分钟，在摇床，平衡的解决方案中使用1％和2.5％二硫苏糖醇碘乙酰胺[50毫米Tris-HCl/pH 8.8，6​​ M尿素，30％甘油和2％SDS]。
   ....

Discussion

创新或只是另一种考马斯亮协议？

目前存在与考马斯亮蓝染色程序的多个协议。他们大多导致轻微或重大修改Neuhoff和同事²最常用的协议之一。康有为的协议的基础上Neuhoff的公式。但它真的蛋白质组学研究的一个替代的考马斯染色的方法吗？我们将图片的两个主要问题，检测限和可用性，证据表明，它绝对是一个有益的染色协议相比其他考马斯亮协议，甚至银色和荧光染色法。

焦点:检测限

在康有为的出版物，他们发现了几个标志蛋白1纳克/带（图2）。但是，在我们看来，一个4-8纳克/乐队的检测限为更可能与实践（见表1）。他们还讨论了有关卓越的灵敏度水平，胶体考马斯亮协议CBB在磷酸，硫酸铵，甲醇和酸性银染自Amersham Pharmacia公司生物技术（银染加套件）G - 250。

Materials

产品名称	公司	目录号	评论
对于IEF和SDS - PAGE电泳:
Immobiline DryStrip凝胶	GE医疗集团	17-6001-94	甚至可以使用2年后到期日期。
Immobiline DryStrip Reswelling托盘	GE医疗集团	80-6371-84	不要用有机溶剂清洗。专为7-18厘米IPG条。
Immobiline DryStrip套件	GE医疗集团	18-1004-30	包括一个托盘，电极支架，阳极和阴极电极，对准和样品杯酒吧和样品杯。
每股盈利3501 XL电源	GE医疗集团	18-1130-05	供应电压高达3500 V。
Multiphor第二电泳单位	GE医疗集团	18-1018-06	移动电极使国际盛事基金在所有长度的IPG胶条（7-24厘米IPG胶条）
PerfectBlue凝胶体系双人小号	Peqlab	45 - 1010 - C	SDS - PAGE电泳在10X10厘米的微型胶格式。凝胶室包括一个冷却系统。
胶体考马斯亮蓝G - 250染色:
染色与盖菜	VWR	216-3412	适合用于小型凝胶。摇床可堆叠。
硫酸铝- 18 -水合物	默克公司	1.01102.5000	我们最好与默克公司的经验。刚上市的5公斤包装。
磷酸	Prolabo	20 624.295	玻璃瓶出售。