本视频将推广一种基于 Kang 方法的胶体考马斯亮蓝 G-250 染色方案 等 用于检测凝胶中平均4 ng的蛋白质。染色在2小时内完成，且无需费力。我们常规采用Kang的方案进行基于凝胶的蛋白质组学分析。
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摘要
摘要
考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue, CBB）是一种常用于SDS-PAGE分离蛋白质后进行显色的染料，具有操作简便和定量性高的优点。此外，它完全兼容质谱法进行蛋白质鉴定。然而，尽管具备这些优势，CBB的灵敏度被认为低于银染或荧光染色，因此在基于凝胶的分析性蛋白质组学研究中较少用于蛋白质的检测。
为了提高考马斯亮蓝（CBB）染色的灵敏度，研究人员对最初的考马斯亮蓝染色方案1进行了多项改进。其中两项主要修改通过将染料分子转化为胶体颗粒，增强了对低丰度蛋白质的检测能力：1988年，Neuhoff 及其同事在基于CBB G-250的染色液中加入了20%甲醇和更高浓度的硫酸铵2；2004年，Candiano 等. 建立了Blue Silver染色法，该方法在硫酸铵和甲醇存在下，将CBB G-250与磷酸结合使用3。然而，这些改进方法最多仅能检测到约10 ng的蛋白质。2002年，Kang 等. 发表了一种在科学界未广泛传播的胶体考马斯亮蓝染色方案，他们针对络合物质对Neuhoff的胶体CBB染色法进行了修改：用硫酸铝替代硫酸铵，并以毒性较低的乙醇取代甲醇4。Kang研究中提出的新型铝基染色法表现出更高的灵敏度，最低可检测到每条带1 ng的蛋白质（磷酸化酶b），且不同蛋白质之间的灵敏度差异较小。
本文展示了Kang氏快速灵敏胶体考马斯亮蓝染色法在蛋白质分析中的应用。我们将以本课题组常规制备的二维凝胶为例，说明该方法的快速且简便的操作流程。
方案
第一部分：采用杯上样法的二维（2-D）凝胶电泳
- IPG胶条重水合与等电聚焦（IEF）
- 使用Immobilin DryStrip重水合托盘，将pH 6-11的Immobilin DryStrip凝胶（7 cm）在125 μl重水合溶液[7 M尿素、2 M硫脲、4% CHAPS、50 mM羟乙基二硫化物和2% IPG缓冲液pH 6-11]中重水合至少10小时。
- 将沉淀的蛋白质样品溶解于等电聚焦样品缓冲液[7 M尿素、2 M硫脲、2% CHAPS、2% ASB-14、50 mM羟乙基二硫化物和2% IPG缓冲液pH 6-11]中，使每100 μl溶液含60–100 μg蛋白质。
- 室温下溶解至少30分钟后，通过阳极杯上样法使用上样杯加入蛋白样品。上样杯体积为100 μl（多通道上样杯最多可容纳150 μl）。
注意：若在聚焦程序开始时加入一个低电压步骤，并在杯中仍有液膜时重新加样，可上样更多样品！ - 在Multiphor II电泳仪中以梯度模式进行等电聚焦，总电压时间为11.1 kVh。
- 平衡与SDS-PAGE
- 等电聚焦完成后，将IPG胶条分别在平衡缓冲液[50 mM Tris-HCl/pH 8.8、6 M尿素、30%甘油和2% SDS]中加入1%二硫苏糖醇（还原）和2.5%碘乙酰胺（烷基化），在摇床上各孵育15分钟。
- 用H2O冲洗平衡后的胶条，并用Whatman滤纸吸干以去除多余的平衡缓冲液。随后将胶条浸入SDS电泳缓冲液（1X）中。
- 第二向电泳采用垂直电泳系统进行SDS-PAGE，分离胶总丙烯酰胺浓度为12%。将平衡好的IPG胶条置于分离胶顶部，并用含溴酚蓝的热琼脂糖溶液[0.5%琼脂糖溶于电泳缓冲液]固定。
- 蛋白质电泳时间为2.5小时，初始电压80 V持续15分钟，随后升至120 V，直至染料前沿迁移至凝胶板底部。
第2部分：使用CBB G-250进行胶体考马斯亮蓝染色
1. 染色液的配制
注意：配制染色液时，请使用高纯度试剂，例如分析纯（p.a.）级别的化学试剂，以及高纯度水，如 Millipore 系统制备的超纯水（Milli-Q 水）。
| 考马斯亮蓝溶液： | 加 H2O 至 2000 ml | |
| 0.02 % (w/v) | CBB G-250 | 0.4 g |
| 5 % (w/v) | 硫酸铝-(14-18)-水合物 | 100 g |
| 10 % (v/v) | 乙醇 (96%) | 200 ml |
| 2 % (v/v) | 正磷酸 (85 %) | 47 ml |
注意：配制染色液时，必须按照以下顺序依次加入各组分：
- 首先将硫酸铝溶解于 Milli-Q 水中
- 然后加入乙醇，均质化，并将 CBB G-250 加入溶液中
- 一旦溶液完全溶解，立即加入磷酸（将酸加入醇类介质中可使考马斯亮蓝分子聚集形成胶体状态）
- 最后用 Milli-Q 水定容
注意：最终染色液呈深绿色偏蓝色外观，并含有大量悬浮的颗粒：
- 切勿过滤此溶液！
- 如果改变制备顺序，将得到一种更偏紫蓝色且灵敏度较低的溶液。
| 脱色液： | 加至 2000 ml H2O | |
| 10 % (v/v) | 乙醇 (96 %) | 200 ml |
| 2 % (v/v) | 正磷酸 (85 %) | 47 ml |
2. 染色步骤
- 第二维分离后，小心地将凝胶从玻璃板上取下，并转移至装有Milli-Q水的染色皿中。
- 在水平摇床上用Milli-Q水洗涤凝胶三次，每次10分钟（洗涤不充分会导致灵敏度降低，因为残留的SDS会干扰染料与蛋白质的结合）。
- 使用前充分振荡考马斯亮蓝溶液，以均匀分散其中的胶体颗粒。
- 将凝胶完全浸没于考马斯亮蓝溶液中，在摇床上振荡孵育2–12小时。该染色过程背景较低，因此可在孵育过程中观察染色进展。
注意：约10分钟后可观察到蛋白质斑点开始出现，孵育2小时内染色程度可达最大值的约80%。若需接近100%的染色效果，建议过夜孵育。在某些情况下，当待染蛋白质含量较高且染色液变为明亮的蓝色时，需更换新的染色液。 - 染色完成后，倒掉考马斯亮蓝溶液，并用Milli-Q水冲洗凝胶两次。
注意：只要溶液中仍有颗粒存在，即可重复使用该染色液；否则应予以废弃（请注意，您的实验室可能对废液处理有特殊规定）。 - 用无绒纸巾清除染色皿中附着的染料颗粒，然后脱色10–60分钟。
注意：也可仅用Milli-Q水洗涤凝胶，但我们仅建议对制备型凝胶采用此法，因为这样会在凝胶表面残留不均匀且微弱的考马斯亮蓝薄膜，可能在扫描过程中产生干扰。 - 最后用Milli-Q水冲洗凝胶两次：凝胶将恢复至原始厚度（醇-酸介质会使凝胶收缩），并在水中中和，进一步增强考马斯亮蓝的显色强度。
第3部分：代表性结果
如果按照上述方案操作，您将在二维凝胶上获得清晰分辨且染色良好的深蓝色蛋白质点。即使与按照 Shevchenko et al.5 所述方法进行银染的二维凝胶相比——该方案声称具有良好的灵敏度和与质谱分析的兼容性——我们仍能达到同等的染色效果。
图1： 上述实验的最终结果。Kang的考马斯亮蓝染色方案（A）的效果与Shevchenko的银染方法相当出色 等 （B）用于二维凝胶电泳后蛋白质的检测。
第4部分：技巧与提示
- 在处理您自己的样品之前，先进行一些测试性染色。由于某些无法解释的原因，我们有时发现即使上样量达到毫克级，目标蛋白仍无法成功检测到。在这种情况下，我们建议制备一系列稀释样品以测试检测灵敏度。
- 如果总体上蛋白质在凝胶中的检测信号较弱，可能的原因是在SDS-PAGE过程中蛋白质未能成功从浓缩胶转移至分离胶。您可以通过对整块凝胶（包括浓缩胶区域）进行染色来检查是否存在此类“粘滞”蛋白。
- 为了快速验证等电聚焦结果，可直接对IPG胶条进行染色，无需进行第二向分离。
- 染色过程中应不时翻转凝胶，使其两面均匀着色（若不移动凝胶，染料仅会结合到凝胶的一侧）。
- 我们发现将染色液储存于避光瓶中可延长其使用寿命（在透明瓶中最多可保存4个月）。
- 染色并成像记录后，可将凝胶置于冰箱中保存数年（若加入酸性溶液，可避免真菌污染）。
- 用于胰蛋白酶消化的凝胶切片的脱色过程可通过在金属浴加热器中加热而加速。
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讨论
是创新，还是又一种考马斯亮蓝实验方案？
目前，考马斯亮蓝染色存在多种实验方案。其中大多数方案均源自Neuhoff及其同事提出的一种常用方案的若干小或大范围修改2。Kang的方案也是基于Neuhoff公式的衍生方法。但这种方法是否确实是蛋白质组学研究中一种有效的考马斯亮蓝染色替代方法？我们将从检测灵敏度和实用性两个主要方面进行阐述，以证明该方案相较于其他考马斯亮蓝染色方法，甚至相较于银染和荧光染色，都具有显著优势。
焦点一：检测限
在Kang的研究中，他们检测到了每条带低至1 ng的多种标记蛋白（图2）。但根据我们的观点，每条带4-8 ng的检测限更符合实际操作情况（表1）。他们进一步讨论了与两种方法相关的更高灵敏度：一种是使用含磷酸、硫酸铵和甲醇的胶体考马斯亮蓝G-250（CBB G-250）染色法，另一种是Amersham Pharmacia Biotechnology公司的酸性银染法（Silver Stain Plus Kit）...
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致谢
我们感谢 Nicola Wiethölter 博士在 1-D 凝胶的制备与染色方面所做的工作。
本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，项目编号 GRK 1089/项目 5，资助对象 ND 和 SM）的资助项目提供经费，并得到于尔根·曼乔特基金会（Jürgen Manchot Stiftung）向 ND 提供的研究奖学金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Immobiline DryStrip 干胶条 | GE Healthcare | 17-6001-94 | 即使超过有效期 2 年仍可使用。 |
| Immobiline DryStrip 再水化托盘 | GE Healthcare | 80-6371-84 | 切勿使用有机溶剂清洗。适用于 7–18 cm 的 IPG 胶条。 |
| Immobiline DryStrip 试剂盒 | GE Healthcare | 18-1004-30 | 包含托盘、电极架、阳极和阴极电极、对齐装置、加样梳和样品杯。 |
| EPS 3501 XL 电源 | GE Healthcare | 18-1130-05 | 可提供最高 3500 V 的电压。 |
| Multiphor II 电泳仪 | GE Healthcare | 18-1018-06 | 可移动电极支持所有长度（7–24 cm IPG 胶条）的等电聚焦电泳。 |
| PerfectBlue 双板凝胶系统 Twin S | Peqlab | 45-1010-C | 用于 10×10 cm 小型凝胶格式的 SDS-PAGE。凝胶槽配有冷却系统。 |
| 带盖染色皿 | VWR international | 216-3412 | 适用于小型凝胶。可在摇床上堆叠使用。 |
| 硫酸铝十八水合物 | Merck & Co., Inc. | 1.01102.5000 | 我们使用 Merck 产品效果最佳。仅提供 5 kg 包装。 |
| 正磷酸 | Prolabo | 20 624.295 | 以玻璃瓶装出售。 |
参考文献
- Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).
- Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).
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重印与许可
