我们描述了一种利用激光捕获显微切割技术，从死后人脑颞上回第三层的同质细胞群体——锥体神经元中分离并提取RNA的方法。随后，我们对mRNA进行线性扩增（基于T7系统），并将样本杂交至Affymetrix人类X3P微阵列。
本文内容
摘要
摘要
我们拟通过分析第三层锥体神经元的基因表达谱，研究精神分裂症患者中观察到的颞上回灰质减少现象。众所周知，大脑皮层是一种高度异质性的结构，包含不同的区域、层次和细胞类型，每种结构单元都具有独特的细胞和分子组成，因而表现出差异化的基因表达谱。为了规避组织异质性带来的混杂效应，我们采用激光捕获显微切割技术（LCM）来分离特定的细胞类型，即锥体神经元。
使用Arcturus XT LCM系统捕获了约500个经Histogene染色液染色的锥体神经元。从捕获的细胞中提取RNA，并使用Arcturus/Molecular Devices试剂盒进行两轮基于T7的线性扩增。Experion LabChip（Bio-Rad）凝胶及电泳图谱显示所获得的a(m)RNA质量良好，转录本长度超过适用于微阵列分析的600nt。所获得的mRNA平均产量为51μg，A260/280比值平均为2.5，表明样品纯度符合要求。采用Affymetrix公司的人类X3P GeneChip探针阵列进行基因表达谱分析。
方案
1）组织切片：
我们从哈佛脑组织资源中心获得了必要的组织样本（对照组 n=9，精神分裂症组 n=9），样本在年龄、性别和死后间隔时间（PMI）方面相匹配（表1）。从布罗德曼42区（颞上回）获取厚度约为3 mm的液氮蒸汽冷冻组织块。
在开始锥体神经元染色之前，必须优化实验条件，以获得最佳的组织“剥离”效果和高质量的RNA。组织“剥离”是指在激光捕获显微切割过程中，被标记用于捕获的神经元黏附到帽膜上并被分离出来，而其余组织则保留在载片上的过程。
优化：
- 为降低会破坏 RNA 质量的 RNase 活性，应对所有表面（包括工作区、切片刀片和载玻片）使用 RNase 去污染溶液（如 RNase Zap）处理，并用 100% 乙醇擦拭。
- 将冷冻切片机温度设定为 -17°C 进行组织切片。这可减小室温（载玻片）、冷冻切片机与干冰之间的温度梯度（见下文完整流程）。若温度低于 -20°C，组织切片易碎裂而无法使用；若温度过高，则温度梯度增大，可能破坏 RNA 完整性。
- 切片厚度应为 8μm，因为过厚的切片最终会影响组织“拾取”效果。此厚度也有助于准确识别锥体神经元以便捕获。
- 使用未带电荷的普通玻璃载玻片（如 Histogene LCM 载玻片），因其在激光捕获过程中不会干扰组织“拾取”。也可使用膜载玻片，但其更适用于分离较大的组织结构，因为在激光捕获过程中膜可能轻微抬升，从而增加红外（IR）激光光斑尺寸并降低细胞特异性。
- 每张玻璃载玻片上放置两个切片，因为每张载玻片上切片超过两个可能因切片过程中持续的温度变化而影响 RNA 质量。
- 切片完成后，立即将载玻片放入置于干冰上的微型载玻片盒中，以保持 RNA 完整性。含有脑组织切片的载玻片盒随后储存在 -80°C，直至后续处理。
我们先前已确定，对于锥体神经元，每例500个细胞足以获得用于微阵列杂交的足够RNA。每例大约需要四张切片，主要原因是切片和染色过程中产生的伪影。
2) 锥体神经元染色：
使用Histogene快速染色液和试剂盒可鉴定锥体神经元，因为它能够使我们可视化这些神经元，同时避免长时间暴露于水溶液中，从而保护RNA的完整性。
- 在染色前，向每100μl染色液中加入1μl RNase抑制剂（例如Promega），以抑制RNase活性。四张切片（2张载玻片）需在1.5ml离心管中将4μl RNase抑制剂加入400μl Histogene染色液中（置于冰上）。每张切片使用97μl该溶液，足以清晰染色以识别锥体神经元。
- 准备脱水系列和二甲苯：将25ml适当浓度的乙醇分装至Histogene试剂盒提供的染色缸中，即2份75%、95%、100%乙醇，以及2个盛有无RNase水的染色缸。除一份75%乙醇染色缸置于-20°C冰箱外，其余均置于冰桶中。在通风橱内，向二甲苯染色缸中加入分子筛以去除多余水分，防止组织“脱落”。
- 开启水浴锅（或加热块），温度设定为42°C，并将一个50ml Falcon管置于支架上后放入水浴锅中。
- 从-80°C取出两张载玻片，在KimWipe纸上解冻约30秒，或直至载玻片边缘开始解冻即可。
- 使用-20°C冰箱中的75%乙醇对载玻片进行短暂固定，时间为30秒。转移载玻片时使用经RNase去除处理的镊子，以减少污染。
- 在无核酸酶水中清洗30秒后，可用PAP防水笔围绕组织切片画圈，以集中染色液；但使用普通玻璃载玻片时此步骤并非必需。
- 用Histogene染色液对四张切片染色20秒，每张切片使用97μl染色液/RNase抑制剂混合液。随后将切片依次浸入预先准备并置于冰上的乙醇中脱水，每步30秒。最后一步100%乙醇应延长至3分钟，以实现充分脱水，确保组织能有效“脱落”并捕获至激光显微切割（LCM）帽上。
- 将载玻片浸入二甲苯中5分钟，随后在通风橱中空气干燥5分钟，再进行捕获操作。
仅在随后立即进行激光捕获时，才应执行染色步骤。为防止污染并确保充分脱水，所有溶液应每处理4至6张切片后更换一次。
3）单细胞激光捕获显微切割：
染色后，使用Arcturus XT系统及其配套软件，通过激光捕获显微切割技术分离第III层的锥体神经元。简而言之，该系统通过在帽盖底部的热塑性薄膜上脉冲发射强度可调的红外激光，使薄膜直接延伸并贴附到目标细胞上。当将帽盖从组织上提起时，目标细胞即被固定在帽盖上而实现捕获。图1展示了该过程的示意图。
在开始本操作之前，必须区分该系统提供的两种帽盖类型。Macro CapSure 帽盖通常用于捕获较大的组织结构，而 CapSure HS 帽盖则设计用于捕获少量单个细胞，因此其用于捕获的有效表面积较小。此外，HS 帽盖带有导轨结构，可防止帽盖与组织切片直接接触，而 Macro 帽盖则无此设计。这些导轨可减少组织折叠带来的影响，避免因 Macro 帽盖直接接触折叠、不平整的组织而导致激光脉冲作用区域（光斑大小）出现变异或偏差。在本实验中，我们选用 HS 帽盖以利用其减少组织折叠影响的优势，但在软件设置中仍保留 Macro 帽盖的参数，以便在捕获大量细胞时最大化捕获区域面积。
- 将载玻片和帽盖装载到 Arcturus XT 仪器上。使用 CapSure HS 帽盖，但程序设置保持在 Macro 模式。勾选“Load with overview”选项框，以获取每张载玻片的概览图像。
- 在 2 倍放大下调节亮度/焦距，以确定最适合激光显微切割的组织区域。应避免选择折叠过多的组织切片，优先选择完整、平滑且染色良好的切片，尤其是靠近目标区域（即第 III 层）的部位。
- 随后，将帽盖置于拟采集区域的上方，确保覆盖第 III 层。在 2 倍放大下，需确认帽盖支架未接触任何折叠处，以免造成帽盖倾斜。
- 接下来，在 40 倍放大下手动确认红外激光点的位置。如果激光点（红光）与蓝色十字不重合，可通过右键单击该点并选择“located IR spot”进行校正。
- 在 40 倍放大下，可根据以下标准识别锥体神经元：（1）细胞呈锥形；（2）可辨认出顶树突和/或基树突的近端部分（图 1A）。
现在调整激光脉冲的功率和持续时间，以捕获锥体神经元。这一点尤为重要，因为这不仅决定了所捕获细胞的特异性，还影响捕获细胞的数量。如果脉冲过弱，可能无法捕获所有已识别的神经元；而如果脉冲过强，则可能额外捕获神经元周围组织或其他细胞。通常情况下，结合本实验所用的组织和细胞特性，激光强度（70 mW）和持续时间（16 msec）所产生的光斑大小约为25 μm，与锥体神经元的尺寸大致相符（图1B）。然而，这些参数需针对每个切片进行微调，以确保每例样本获得大致相同的光斑尺寸。如果“lift”效果不理想，可通过增加捕获细胞数量来保持每例样本所获得的RNA量具有可比性。但需注意，整个捕获过程（包括染色）的时间应控制在1.5小时以内，超过该时长可能会影响RNA的质量。
- 首先，通过点击位置功能的加号来保存帽的位置。这样，如果因任何原因需要取下帽并随后将其重新放回相同位置，帽将始终返回到您之前调整斑点大小时所设定的精确位置。
- 在控制框中输入以下数值：将“功率”设为 70，将“持续时间”设为 16。取消勾选“自动移动载物台”选项，并确保右侧面板上的尺寸符号与所选符号一致。
- 选择圆形选项（右下角），以选定您希望测试捕获的神经元，然后通过点击“测试红外斑点”激活激光。
- 激光产生的斑点首先应在捕获目标周围形成一个清晰的深色环。如果该环颜色过浅，则表示细胞未被捕获成功；如果深色环中央出现一个深色斑点，则说明激光强度或持续时间过大，可能对捕获细胞内的 RNA 产生不利影响。请确保该环足够大以完全包含细胞，但又足够小以避免包含不需要的组织或其他细胞。
- 在您希望捕获的组织层内不同区域重复此过程，以检查斑点大小是否随位置变化而改变，并相应地进行调整。
- 激光斑点调整完成后，继续识别用于捕获的锥体神经元。我们每个样本通常捕获约 500 个细胞，可获得约 500 pg 总 RNA。为减少捕获时间，我们通常仅使用一个切片，因为每个切片均需重新调整帽的位置。在确定所有所需细胞后，按下激光捕获按钮，所有细胞将自动被捕获至帽上（图 1C）。
- 所有细胞捕获完成后，将帽移至载玻片上无组织切片的区域。返回原捕获位置，确认至少 90% 的神经元已被移除。若未达到该比例，请勿尝试重新捕获相同细胞，而应定位大多数细胞已被捕获的区域，并在同一区域内补充捕获更多细胞。随后将帽移至质控（QC）站。
- 将帽放入 Applied Biosystems 提供的 0.5 ml 微量离心管（货号 # N8010611）中，管内已加入 50 µL 裂解缓冲液（PicoPure RNA Isolation Kit）。该帽的设计可完美适配此特定离心管，防止缓冲液泄漏。
- 将整个装置倒置，确保裂解缓冲液完全覆盖帽的表面，并将其置于已预热至 42°C 水浴中的 50 ml Falcon 管底部。神经元在此条件下孵育 30 分钟，以使组织从帽上完全脱离。
- 孵育结束后，将管和帽组件在 800g 条件下离心 2 分钟。取出帽后，将剩余的细胞提取物保存于 -80°C，直至进行 RNA 提取。作为额外预防措施，可在激光捕获装置的质控（QC）站重新检查帽，以确认所有神经元均已从帽上完全移除。
4）从特定神经元群体中获取 RNA：
可以直接从捕获步骤进入分离步骤，或者将保存在-80°C冰箱中的样品解冻。在本实验中，我们首先收集了所有需要的样品，并将其保存在-80°C，然后进行RNA分离。
使用PicoPure核酸提取试剂盒进行RNA提取，该试剂盒专为从LCM样品中提取少量细胞并保留低丰度mRNA而设计。通常，我们遵循试剂盒提供的操作说明。以下简要描述该流程。
- 解冻后，加入试剂盒中提供的 70% 乙醇，并在预处理的纯化柱中离心，使 RNA 结合到柱上的滤膜。
- 洗涤后，用 DNase 处理 RNA，以确保完全去除 DNA，避免 DNA 干扰。此步骤在实时定量反转录 PCR（qRT-PCR）等下游应用中尤为重要。
- 完成 DNA 消化后，进行另一次洗涤步骤。在将纯化柱转移至另一微量离心管前，请检查柱中是否残留洗涤缓冲液，因为最终样品中若含有缓冲液，将导致可用于扩增的起始 RNA 量减少。为确保无残留，我们建议将最后一次洗涤步骤的离心时间设为 2.5 分钟，而非试剂盒说明书建议的 2 分钟。
- 最后，加入洗脱缓冲液，在纯化柱的滤膜上孵育 1 分钟，随后离心，以洗脱总 RNA。
- 用移液器取 1.3 µl 各样品分别加入 0.5 ml 离心管中，用于 Experion HighSens LabChip 分析。其余样品于 -80°C 冻存。
在分离RNA时，质量控制至关重要，尤其是在RNA起始量较少而后续实验（如微阵列实验）所需用量较大（15μg）的情况下。因此，必须在整个操作过程中多个时间点对提取的RNA进行质量控制。第一步是在RNA提取完成后进行。我们通过Experion HighSens LabChip系统生成的电泳图谱和虚拟凝胶图像，对18S/28S条带的总体形态进行宏观评估，以判断总RNA的完整性。该方法快速高效，可提供两种评估RNA质量的方式——电泳图谱和虚拟凝胶（图2）。若总RNA质量相对较好（图2A、B与C、D相比），则进一步对占总RNA约2%的mRNA进行线性扩增。
5) 线性扩增：
为了获得足够量的RNA用于后续的微阵列杂交和qRT-PCR实验，有必要对激光显微切割组织中提取的RNA进行扩增。为了尽量减少基于T7的线性扩增可能带来的干扰因素，我们通过最大限度地增加起始的激光显微切割组织材料量，从而减少了所需的扩增轮数。
我们的初步数据（未显示）表明，对从含有约500个细胞的组织中提取的总RNA进行两轮线性扩增（使用RiboAmp HSPLUS试剂盒），可产生约50μg的aRNA——足以同时用于微阵列和qRT-PCR实验。如有可能，应避免在0.2 ml和0.5 ml离心管之间不必要的样品转移，建议在PCR仪中使用0.5 ml模块，并使用试剂盒中提供的0.5 ml离心管。
同样，所采用的实验方案遵循试剂盒提供的说明书，此处仅描述其简要版本。
- 向总RNA样本（约11μl）中加入1μl提供的引物，在65°C孵育5分钟，随后在4°C冷却1分钟。
- 加入第一链cDNA反应组分以及SuperScript III反转录酶，在42°C孵育1小时。
- 第二链cDNA合成后，使用提供的纯化柱对所得cDNA进行纯化。建议在将样本与结合缓冲液转移至纯化柱后，对样本管进行两次离心——第一次在样本转移至纯化柱后进行，因为转移后最多可能有1μl样本残留在管壁上。
- 用提供的洗涤缓冲液洗涤cDNA，并用洗脱缓冲液洗脱纯化的cDNA。
- 加入体外转录（in vitro transcription）组分，在42°C孵育6小时。
- 经过DNase处理后，使用提供的缓冲液对生成的aRNA进行纯化，最终用总共12μl洗脱缓冲液进行洗脱。
RNA 经过另一轮线性扩增（使用不同的引物——参见试剂盒说明书），之后进行更多的质量控制步骤。取 1 µL 样品稀释至约 250 ng/µL，利用 StdSens LabChip（Experion）测定 mRNA 转录本的长度和浓度。传统的 Affymetrix 基因芯片技术要求 mRNA 至少为 600 个核苷酸长度才能被检测到。因此，从 LabChip 获得的凝胶图像和电泳图谱应显示此最小 mRNA 转录本长度（图 3）。
通过 NanoDrop 分光光度计分析进行额外的质量控制，其中由两种光密度（即 A260 和 A280）的比值确定 RNA 纯度。光密度比值约为 2.1 的样本应标记用于基因表达分析，尽管比值高达 2.7 的样本也显示出相当的杂交质量。RNA 浓度还应保持在 800 ng/μl 至 1 μg/μl 之间，因为低于此浓度的样本在储存期间（即使在低于 -80°C 的温度下）会发生 RNA 降解，并可能导致微阵列结果不理想。
6) 用于 Affymetrix 芯片分析的 mRNA 样本生物素标记：
使用 Molecular Devices 公司的 TURBO Biotin 标记试剂盒（末端标记）对扩增样品获得的 aRNA 进行标记。此处提供该操作步骤的简化版本。
- 根据初始浓度，通过添加无核酸酶水或将样品在真空离心浓缩仪中浓缩，将每份20 μg aRNA样品的体积调整至总体积13 μl。尽管Affymetrix芯片仅需15 μg，但我们仍在初始反应中加入20 μg，因为在孵育和离心过程中会损失部分RNA。
- 在85°C下孵育生物素反应30分钟，然后在4°C下冷却。
- 使用试剂盒中提供的专用柱子通过离心去除多余的生物素标记。在某些情况下，特别是对于降解的mRNA（例如来自福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）样品的mRNA），单次离心步骤可能无法完全洗脱所有mRNA。此时建议向柱子中加入1–5 μl额外的无核酸酶水，并再进行一次1分钟的离心步骤，以确保大部分标记样品被洗脱。
- 最终体积为20 μl，浓度为1 μg/μl。如果添加了额外的无核酸酶水，需使用真空离心浓缩仪将样品浓缩至正确体积。我们建议在开始杂交前将储存浓度保持在800 ng/μl以上，因为低于此浓度可能导致储存和/或杂交过程中发生降解，从而导致微阵列结果不佳。
随后使用Affymetrix公司的人类X3P GeneChip探针阵列对aRNA进行杂交并分析基因表达谱。由于该芯片专为降解程度较高的aRNA设计，因此我们出于谨慎考虑采用了该芯片，因为许多不可控因素可能影响死后组织样本的质量。由于本实验室不具备杂交所需的适当设施，该过程在Partners基因组核心 facility 完成。
代表性结果：
1+2+3）组织切片、锥体神经元染色及激光显微切割：
上述方案应获得两张载玻片，每张载玻片包含四个切片区域。每个切片区域应平整，撕裂、裂纹和折叠现象应尽可能少。染色正确时，染色结果将清晰显示大小约为 20 - 25μm、呈锥体形状并具有可见顶树突的深染锥体神经元。使用 CapSure HS 帽在宏观模式下，并针对每个切片区域正确调整激光功率和强度，每个切片/样本可获得约 500 - 700 个细胞，总 RNA 产量至少达到 500pg。约 85 - 100% 的神经元会黏附至帽上（图 1）。
4) 从特定神经元群体中获取 RNA：
如上所述，在完成总RNA提取后，我们通过Bio-Rad Experion系统获取电泳图谱和虚拟凝胶图像以检测RNA质量。在电泳图谱中，应可见两个明显峰，分别对应18S和28S核糖体RNA组分。然而，对于死后组织样本，情况并不总是如此，因为在切片前可能已受到多种因素影响而导致组织降解。此时通常会观察到一个较大的降解峰，18S处出现一个较大的主峰，而28S峰则较小（图2A、B）。只要各样本间的电泳图谱轮廓具有可比性，我们发现该标准所对应的mRNA质量足以满足后续进行RT-PCR和微阵列研究的要求（Imbeaud等，2005）。
如果降解过于严重——表现为电泳图谱曲线下面积过大，或峰不可见（图2C、D）——应从组织中重新捕获细胞。我们还建议在重新捕获细胞之前进行组织刮取测试，即从切片的完整片段（而不仅仅是细胞）中提取RNA，以确定组织块本身是否已发生降解。
5）线性扩增：
为了检测两轮线性扩增后mRNA的质量，我们同时使用了Bio-Rad Experion StdSens LabChip和NanoDrop分光光度计。传统的Affymetrix微阵列技术要求mRNA长度至少达到600个核苷酸才能被检测到，本实验方案可满足该要求。事实上，检测到的mRNA长度可达1000个核苷酸左右。电泳图谱也反映了这一结果，表现为随时间推移出现的大幅峰值逐渐缓慢下降（图3A、B）。
NanoDrop 测定结果显示，各样本的 A260/A280 比值平均为 2.5，表明 mRNA 完整性良好（表 2）。
我们的结果表明，采用本方案所获得的RNA在数量和质量上均足以通过Affymetrix人类X3P GeneChip检测基因表达差异。
6) 用于 Affymetrix 芯片分析的 mRNA 样本生物素标记：
在与 Affymetrix 人类 X3P GeneChip 杂交后，我们获得的平均呼叫百分比为 26.6%（表 2），表明杂交效果良好且探针信号强度适中。
表1：队列总结
| 样本 | 组别 | 性别 | 年龄 | 死亡后间隔时间（PMI） |
| C1 | 对照组 | F | 79 | 15.00 |
| C2 | 对照组 | M | 22 | 21.47 |
| C4 | 对照组 | M | 75 | 20.25 |
| C5 | 对照组 | M | 80 | 15.50 |
| C6 | 对照组 | F | 58 | 21.08 |
| C8 | 对照组 | M | 61 | 17.00 |
| C10 | 对照组 | F | 71 | 20.50 |
| C11 | 对照组 | F | 90 | 12.66 |
| C12 | 对照组 | F | 86 | 6.92 |
| 均值 | 4男/5女 | 69.11 | 16.71 | |
| S1 | 精神分裂症组 | F | 93 | 6.92 |
| S2 | 精神分裂症组 | M | 55 | 21.40 |
| S3 | 精神分裂症组 | F | 67 | 21.80 |
| S4 | 精神分裂症组 | F | 55 | 22.00 |
| S5 | 精神分裂症组 | M | 36 | 17.97 |
| S6 | 精神分裂症组 | M | 62 | 10.75 |
| S8 | 精神分裂症组 | F | 92 | 17.80 |
| S11 | 精神分裂症组 | M | 56 | 21.83 |
| S12 | 精神分裂症组 | F | 88 | 13.33 |
| 均值 | 4男/5女 | 68.11 | 16.90 |
缩写：F - 女性，M - 男性，PMI - 死后间隔时间，schizoph. - 精神分裂症。
表2：RNA浓度、质量及杂交效率结果汇总
| 样品 | [mRNA] ng/μL | A260/A280 | 探针强度 | 检出率百分比 |
| C1 | 1318.01 | 2.67 | 63 | 19.5 |
| C2 | 2312.93 | 2.37 | 147 | 30.6 |
| C4 | 1811.92 | 2.44 | 69 | 26.6 |
| C5 | 1316.26 | 2.51 | 78 | 34.7 |
| C6 | 1663.24 | 2.39 | 66 | 33.8 |
| C8 | 633.05 | 2.54 | 101 | 15.2 |
| C10 | 1326.4 | 2.47 | 92 | 32.5 |
| C11 | 994.24 | 2.75 | 76 | 22.4 |
| C12 | 817.23 | 2.7 | 56 | 15.2 |
| S1 | 2560.88 | 2.47 | 78 | 25.0 |
| S2 | 2169.61 | 2.43 | 76 | 26.5 |
| S3 | 2067.32 | 2.52 | 87 | 22.1 |
| S4 | 1563.89 | 2.75 | 82 | 28.1 |
| S5 | 2071.44 | 2.44 | 88 | 28.2 |
| S6 | 2532.59 | 2.34 | 72 | 30.7 |
| S8 | 2189.22 | 2.5 | 62 | 31.8 |
| S11 | 1669.89 | 2.47 | 41 | 27.3 |
| S12 | 1739.35 | 2.47 | 42 | 28.0 |
| 均值 | 1708.75 | 2.51 | 76.44 | 26.57 |
图 1：激光捕获显微切割过程的总结。 A）锥体神经元通过形态学方法进行鉴定。B）激光脉冲穿过热塑性薄膜后，细胞黏附至帽膜上，因此不再留在载玻片上，而周围组织则保留在原位。C）激光捕获后，均一细胞群体黏附在 CapSure 帽膜上的显微照片。
图 2：总 RNA 质量控制。 A+B) 显示分离后高质量总 RNA 的结果，而 C+D) 显示总 RNA 分离后不应出现的低质量情况。A) 电泳图谱中可见清晰的 18S 和 28S 峰，与 (B) 中的虚拟凝胶相对应。C) 电泳图谱显示曲线下面积较大，且无明显的 18S/28S 峰，提示 RNA 已发生降解，这一点在虚拟凝胶 (D) 中也有所体现。
图 3：mRNA 质量控制。 A+B) 电泳图谱（A）和虚拟凝胶图（B），显示进行微阵列研究所需的 mRNA 转录本长度（片段分布），即超过 600 个核苷酸（nt）。C+D) 电泳图谱（C）和虚拟凝胶图（D），显示 mRNA 片段分布不足的情况，其中 mRNA 转录本长度未超过 200 nt。
讨论
本文旨在定制一种利用Arcturus XT系统及相关RNA提取试剂盒，从异质性尸检脑组织中分离出均一细胞群体的实验方案。如上所述，我们对厂商提供的原始方案进行了一些修改，以最大限度地保持RNA的完整性。成功捕获单个细胞完全依赖于在捕获前优化各项步骤，以获得数量最多且RNA质量良好的细胞。这些步骤包括与组织切片和染色相关的各种参数。简而言之，在组织制备方面，具体包括：1）降低切片时的温度梯度；2）每张载玻片仅放置两个切片；3）所有脱水步骤均在冰上进行；4）在染液中添加RNase抑制剂；5）将最后一步100%乙醇中的脱水时间延长至3分钟。
关于捕获，我们认为使用CapSure HS帽并配合显微切割软件的Macro模式设置，应能确保获得最佳结果。捕获单个细胞时，必须控制环境湿度，因为高湿度会显著降低组织的“提升”效果。高温也会对RNA质量产生不利影响。
使用PicoPure试剂盒进行RNA提取时，包含两个洗涤步骤。在将样品转移至另一微量离心管进行RNA洗脱前，必须确保完全去除所有洗涤缓冲液，因为最终样品中残留的缓冲液会导致可用于扩增的起始RNA量减少。为确保彻底去除缓冲液，我们采用2.5分钟的离心时间，而不是试剂盒说明书建议的2分钟。
在大多数情况下，线性扩增步骤按照制造商的说明书进行。然而，使用该方案时应注意两个关键点：1）尽量减少在离心管之间转移样品时造成的RNA损失，建议仅使用配套的0.5 ml离心管，并配合0.5 ml适配块在PCR仪中进行操作；2）在将样品转移至纯化柱以纯化cDNA时，第一次转移后务必对样品管进行短暂离心，以收集管壁残留液体。这样可额外获得1–2 µl样品加入纯化柱，从而提高cDNA的回收率。
当使用TURBO末端标记试剂盒对有限量的aRNA样本进行生物素标记时，我们建议额外添加几个 μ在上柱前加入数微升水，以增加从柱子中提取的标记RNA产量。额外延长一分钟离心时间也会对此有所帮助，特别是在处理降解组织（如FFPE组织）时。
我们确信，该实验方案能够帮助使用者从异质性的死后脑组织中分离出小而均一的结构，例如单一的细胞群体。这可以减少周围结构及其他细胞类型在脑内各层中造成的稀释效应，从而使研究结果更特异性地反映目标细胞类型的特征。由于所获得RNA的质量足以用于微阵列研究，我们得以进一步精确定位在疾病状态下受影响的特定细胞群体的分子特征谱。
披露
本视频文章的制作由 Life Technologies 赞助。
致谢
我们衷心感谢Molecular Devices Analytical technologies/Arcturus慷慨捐赠本研究所用的试剂。同时感谢哈佛组织资源中心提供尸检后的人类脑组织。资助：RO1MH76060 和 P50MH080272。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4.5” 镊子 | VWR international | 82027-392 | |
| Arcturus XT™ 激光显微切割（LCM）系统 | MDS Analytical Technologies | 13821-00 | |
| CapSure™ HS LCM 帽 | MDS Analytical Technologies | LCM 0214 | |
| CapSure® Macro LCM 帽 | MDS Analytical Technologies | LCM 0211 | |
| Experion™ 自动电泳仪 | Bio-Rad | 700-7001 | |
| Experion™ RNA HighSens 芯片 | Bio-Rad | 700-7155 | 10 片 |
| Experion™ RNA HighSens 试剂 | Bio-Rad | 700-7156 | 10 片 |
| Experion™ RNA StdSens 芯片 | Bio-Rad | 700-7153 | 10 片 |
| Experion™ RNA StdSens 试剂 | Bio-Rad | 700-7154 | 10 片 |
| Falcon® 聚丙烯圆锥形离心管 | BD Biosciences | 352070 | |
| GeneAmp® 带凸盖的薄壁反应管 | Applied Biosystems | N8010611 | |
| GeneChip® 人 X3P 芯片 | Affymetrix | 900516 | 6 片 |
| Histogene® LCM 冷冻切片染色试剂盒 | MDS Analytical Technologies | KIT0401 | 用于染色液、染色缸、乙醇和二甲苯 |
| Histogene™ LCM 载玻片 | MDS Analytical Technologies | 12231-00 | |
| 显微载玻片盒 | VWR international | 48444-004 | |
| Microm HM 505E 冷冻切片机 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22-050-350 | 当前产品已停售，此为类似产品的目录编号 |
| 微处理器控制 280 系列水浴锅 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 51221048 | 型号 282 |
| 分子筛 | EMD Millipore | MX1583L-1 | |
| NanoDrop 1000 分光光度计 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | n/a | NanoDrop 1000 已停售，NanoDrop 2000 性能相当 |
| 无核酸酶水 | Ambion | AM9932 | |
| PEN 膜玻璃载玻片 | MDS Analytical Technologies | LCM 0522 | |
| PicoPure® RNA 提取试剂盒 | MDS Analytical Technologies | KIT0204 | |
| RiboAmp®HSPLUS 生物素标记试剂盒 | MDS Analytical Technologies | KIT0511B | 12 次反应，包含 TURBO 生物素标记™ 试剂盒 |
| RNase Zap® | Ambion | AM9780/2 | |
| 无 RNase 的 DNase 试剂盒 | Qiagen | 79254 | |
| RNasin® Plus | Promega Corp. | N261B | |
| SuperScript™ III 逆转录酶 | Invitrogen | 18080-044 |
参考文献
- Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res. 33, e56-e56 (2005).
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