基因微阵列是在全基因组水平上进行基因表达谱分析的强大工具。该技术广泛应用于包括发育生物学和毒理学在内的多种生物学领域。在本视频中，我们详细介绍了一种利用全面的寡核苷酸微阵列平台对斑马鱼进行全基因组表达分析的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
基因微阵列技术能够在全基因组范围内对转录本水平进行定量测量和基因表达谱分析。该技术广泛应用于多种生物学领域的研究中，包括针对发育阶段、疾病状态以及毒性反应的全局基因表达分析。本文展示了一种利用全面的斑马鱼特异性寡核苷酸微阵列平台进行全局基因表达分析的技术流程。该斑马鱼表达微阵列平台包含385,000个探针，探针长度为60个碱基，可检测37,157个靶标，每个靶标最多包含12个探针。该平台整合了来自多个基因组数据库（包括Ensembl（http://www.ensembl.org）、VEGA（http://vega.sanger.ac.uk）、UCSC（http://genome.ucsc.edu）和ZFIN（http://www.zfin.org））中所有可获得的斑马鱼cDNA及基因组信息，因此能够对当前已知的斑马鱼转录组实现全面覆盖。该斑马鱼表达微阵列由Roche NimbleGen（Madison, WI）制备。本技术演示包括cDNA产物的荧光标记、标记产物与微阵列平台的杂交，以及采用单色分析策略进行芯片扫描以获取信号。
方案
第1部分：cDNA的荧光标记
微阵列实验中使用的Cy3染料对光降解敏感，操作过程应尽量在避光条件下进行。标记方案改编自BioPrime Array CGH基因组标记系统手册1。
- 标记反应所用试剂应保存在 -20°C。从 BioPrime Array CGH 基因组标记系统中取出 2.5X 随机引物缓冲液、10X dCTP 混合液和无核酸酶水，同时取出 Cy3-dCTP 染料，置于室温融化。融化后，所有试剂在使用前需短暂离心。
- 每个待分析的 cDNA 样品均需进行独立的标记反应。在 0.6 ml 厚壁管中加入 500 ng cDNA、40 μl 2.5X 随机引物缓冲液，并加入无核酸酶水至总体积为 86 μl。
- 充分混匀后短暂离心。将反应体系在热循环仪中于 100°C 孵育 5 分钟。
- 立即转移至冰浴中，冰上静置 10 分钟。
- 向每根管中加入 10 μl 10X dCTP 混合液、2 μl 1 mM Cy3-dCTP 和 2 μl Exo Klenow DNA 聚合酶。Exo Klenow DNA 聚合酶应保留在冷冻状态，仅在使用时取出，并始终置于冰上。
- 充分混匀反应体系后短暂离心。
- 将反应体系在热循环仪中于 37°C 孵育 16 小时。
第2部分：标记cDNA的沉....
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讨论
许多微阵列实验方案（包括此处详述的方案）均采用荧光染料来检测和定量杂交信号。Cy3荧光染料对光和臭氧降解敏感，因此建议在尽可能弱的光照条件下进行操作。此外，微小的灰尘颗粒可能干扰杂交和扫描过程，应特别注意确保工作区域清洁无尘。
针对本实验步骤中所述的标记方案，存在多种替代方法。建议测试不同的标记方案，以确定适用于每种特定表达微阵列平台的最佳标记程序。此处演示的方案已针对由罗氏NimbleGen公司打印的这一特定表达芯片平台进行了优化。此外，我们发现罗氏NimbleGen芯片用户指南中详述的标记方案同样有效。若将本方案应用于其他表达芯片平台（尤其是其他厂商生产的平台）时，应谨慎行事，因为杂交特性在很大程度上取决于芯片平台的打印方法。
将该表达谱芯片实验方案与我们的RNA提取和cDNA合成方案相结合，在本实验室常规可获得可重复的高质量基因表达谱芯片数据。这对于所有表达谱芯片分析而言均至关重要，因为最终数据的质量最终取决于这些初始步骤的质量。在最终表达谱芯片分析之前的任何一步若未达到最佳效果，都将影响最终数据的质量。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 阵列微型离心干燥仪 | ISC Bioexpress | C-1303-T | |
| BioPrime 阵列CGH基因组标记系统 | Invitrogen | 18095-011 | |
| 氰基3-dCTP | PerkinElmer, Inc. | NEL576 | |
| GenePix 4000B | Molecular Devices | GENEPIX 4000B | |
| Microcon YM-30 | EMD Millipore | 42411 | |
| NimbleGen 阵列处理配件 | Roche Group | 5223539001 | |
| NimbleGen 杂交试剂盒 | Roche Group | 5223474001 | |
| NimbleGen 杂交系统 4 | Roche Group | 5223652001 | |
| NimbleGen 洗涤缓冲液试剂盒 | Roche Group | 5223504001 | |
| X1 混匀器 | Roche Group | 5223725001 |
参考文献
- BioPrime Array CGH Genomic Labeling System Manual. , Version C. (2004).
- Roche NimbleGen Arrays User's Guide for Gene Expression Analysis. , Version 3 (2008).
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