利用斑马鱼寡核苷酸微阵列平台进行全基因组表达分析

摘要

基因微阵列是在全基因组水平上进行基因表达谱分析的强大工具。该技术广泛应用于包括发育生物学和毒理学在内的多种生物学领域。在本视频中，我们详细介绍了一种利用全面的寡核苷酸微阵列平台对斑马鱼进行全基因组表达分析的实验方案。

摘要

基因微阵列技术能够在全基因组范围内对转录本水平进行定量测量和基因表达谱分析。该技术广泛应用于多种生物学领域的研究中，包括针对发育阶段、疾病状态以及毒性反应的全局基因表达分析。本文展示了一种利用全面的斑马鱼特异性寡核苷酸微阵列平台进行全局基因表达分析的技术流程。该斑马鱼表达微阵列平台包含385,000个探针，探针长度为60个碱基，可检测37,157个靶标，每个靶标最多包含12个探针。该平台整合了来自多个基因组数据库（包括Ensembl（http://www.ensembl.org）、VEGA（http://vega.sanger.ac.uk）、UCSC（http://genome.ucsc.edu）和ZFIN（http://www.zfin.org））中所有可获得的斑马鱼cDNA及基因组信息，因此能够对当前已知的斑马鱼转录组实现全面覆盖。该斑马鱼表达微阵列由Roche NimbleGen（Madison, WI）制备。本技术演示包括cDNA产物的荧光标记、标记产物与微阵列平台的杂交，以及采用单色分析策略进行芯片扫描以获取信号。

方案

第1部分：cDNA的荧光标记

微阵列实验中使用的Cy3染料对光降解敏感，操作过程应尽量在避光条件下进行。标记方案改编自BioPrime Array CGH基因组标记系统手册¹。

1. 标记反应所用试剂应保存在 -20°C。从 BioPrime Array CGH 基因组标记系统中取出 2.5X 随机引物缓冲液、10X dCTP 混合液和无核酸酶水，同时取出 Cy3-dCTP 染料，置于室温融化。融化后，所有试剂在使用前需短暂离心。
2. 每个待分析的 cDNA 样品均需进行独立的标记反应。在 0.6 ml 厚壁管中加入 500 ng cDNA、40 μl 2.5X 随机引物缓冲液，并加入无核酸酶水至总体积为 86 μl。
3. 充分混匀后短暂离心。将反应体系在热循环仪中于 100°C 孵育 5 分钟。
4. 立即转移至冰浴中，冰上静置 10 分钟。
5. 向每根管中加入 10 μl 10X dCTP 混合液、2 μl 1 mM Cy3-dCTP 和 2 μl Exo Klenow DNA 聚合酶。Exo Klenow DNA 聚合酶应保留在冷冻状态，仅在使用时取出，并始终置于冰上。
6. 充分混匀反应体系后短暂离心。
7. 将反应体系在热循环仪中于 37°C 孵育 16 小时。

第2部分：标记cDNA的沉淀

1. 在继续本实验方案之前，打开NimbleGen杂交系统，并使系统平衡至42°C。
2. 对于每个反应，将一个Microcon离心柱放入一个1.5 ml离心管中。向每个柱中加入300 μl 0.1X SSC，随后加入标记反应液（100 μl）。
3. 将装有柱子的离心管在4°C下以16,100 × g离心10分钟。
4. 弃去穿滤液（可能略带粉红色），并向柱中再加入300 μl 0.1X SSC。
5. 再次在4°C下以16,100 × g离心10分钟。
6. 弃去穿滤液，并向柱中额外加入300 μl 0.1X SSC。
7. 在4°C下以16,100 × g离心12分钟。
8. 弃去穿滤液。最后一次洗涤后穿滤液应为无色透明，此时应可在柱上观察到粉红色的标记cDNA。
9. 向柱中加入100 μl无核酸酶水。将柱子从1.5 ml离心管中取出，倒置放入一个新的1.5 ml离心管中。
10. 在4°C下以2,300 × g离心2分钟。标记的cDNA应被重新水化并溶解于收集在管底的水中。
11. 按照制造商说明使用NanoDrop ND-1000分光光度计测定DNA浓度，并通过计算碱基与染料的比值评估染料掺入效率，其中核苷酸与Cy3的比值等于A₂₆₀/A₅₅₀比值乘以23.15。碱基与染料的比值应在50至80之间。
12. 若cDNA标记充分，取6 μg标记cDNA分装至新的1.5 ml离心管中。
13. 加入0.1倍体积的3 M NaOAc（pH 5.2）和1倍体积的异丙醇。将混合物于室温避光孵育30分钟。
14. 随后在室温下以16,100 × g离心20分钟。
15. 小心弃去上清液，避免扰动DNA沉淀（应呈粉红色）。
16. 通过加入500 μl 70%乙醇进行乙醇洗涤，并轻轻倒置混匀。
17. 在室温下以16,100 × g离心5分钟。
18. 移去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，使沉淀在空气中干燥5分钟。此步骤中沉淀可选择在-20°C保存，或直接继续进行杂交步骤。

第3部分：杂交

杂交步骤改编自罗氏NimbleGen芯片基因表达分析用户指南²。

1. 将沉淀溶解于 5 μl 无核酸酶的水中。
2. 待沉淀完全溶解后，加入表 1 中列出的杂交组分。杂交组分来自 Roche NimbleGen 杂交试剂盒。加入所有组分后，总体积应为 18 μl。充分混匀，并短暂离心，使液体沉降至管底。
3. 下一步是将标记的 cDNA 在 95°C 的金属浴中孵育 5 分钟，以进行变性。
4. 变性完成后，立即将管子转移至 NimbleGen 杂交系统，同时按以下步骤准备芯片。
5. 微阵列芯片应始终小心操作，并按照制造商的说明进行储存。Roche NimbleGen 建议将表达芯片避光、置于干燥剂中，并在室温下保存。
6. 将芯片装入 NimbleGen 芯片处理配件中提供的精密混合对准工具（PMAT）中。
7. 将一个 X1 混合器装入 PMAT，并用镊子移除粘性条带。牢固关闭 PMAT。通过 PMAT 上的孔对混合器施加压力，然后缓慢打开，使芯片和混合器从 PMAT 上分离。
8. 使用压辊在混合器外部均匀施压，确保混合器与芯片之间完全密封，并排除任何气泡。将芯片-混合器复合体放置到杂交系统中进行预热。
9. 使用移液器缓慢将 15 μl 标记的样品加入填充口（位于混合器中心的孔）。对移液器施加缓慢而稳定的压力，使样品在混合器内均匀扩散，避免产生气泡。用粘性条带擦去填充口多余的样品，并密封填充口。
10. 关闭卡扣，使用 NimbleGen 杂交系统上的程序 B 开始杂交溶液的混合。让微阵列在系统中杂交 16–20 小时。

第4部分：杂交后洗涤与微阵列扫描

洗涤和扫描步骤改编自罗氏NimbleGen芯片基因表达分析用户指南²。

1. 当杂交接近完成时，按照表2所述配制洗涤缓冲液。将洗涤缓冲液IA在水浴中预热至42°C。
2. 打开GenePix 4000B芯片扫描仪，使用前让仪器预热约15分钟。
3. 将预热的洗涤缓冲液IA倒入培养皿中。
4. 从NimbleGen杂交系统中取出芯片-混合器复合物，并将其滑入夹具（NimbleGen芯片处理配件中提供）。将整个组件浸入预热的洗涤缓冲液IA中，小心地通过剥离方式移除混合器。
5. 从夹具中取出芯片，在洗涤缓冲液IA中轻轻振荡15秒。
6. 迅速将芯片转移至装有室温洗涤缓冲液IB的载玻片架中，剧烈振荡2分钟。
7. 将载玻片架转移至洗涤缓冲液II中，振荡1分钟。
8. 将载玻片架转移至洗涤缓冲液III中，振荡15秒。
9. 将芯片放入载玻片干燥离心机中，离心2分钟以彻底去除水分。随后立即进行扫描。
10. 建议在扫描完成后立即进行扫描，因为染料对光和臭氧均敏感。
11. 将芯片（条形码朝下）装入GenePix 4000B芯片扫描仪中。
12. 打开GenePix Pro软件并开始芯片扫描。Roche NimbleGen基因表达芯片采用单色杂交策略，因此仅需一个波长进行扫描。使用532 nm激光扫描Cy3荧光信号。打开硬件设置对话框，将532 nm激光的PMT值设为500。
13. 在硬件设置对话框中，将激光功率设为100%，像素尺寸设为5微米，扫描线平均次数设为1，聚焦位置设为0微米。
14. 执行预扫描并设定扫描区域。
15. 开始正式扫描。
16. 扫描完成后检查图像直方图。理想情况下，1e-5的归一化计数值应接近65,000的饱和极限，意味着约有1-2%的特征点达到饱和。如果归一化计数值低于1e-5，则提高PMT增益并重新扫描；如果归一化计数值高于1e-5，则降低PMT增益并重新扫描。
17. 扫描完成后保存图像。建议采用标准命名规则命名图像，以便于后续引用。现在可将图像导入所选的数据分析软件，进行数据归一化及信号强度值的计算。

代表性结果

在开始使用 0.1X SSC 进行洗涤时，即可初步评估 cDNA 的 Cy3 荧光标记反应效率。在随后的每一次洗涤过程中，穿流液的颜色应逐渐变淡，最后一次洗涤的穿流液应为无色透明。此外，在这些洗涤步骤中，应能在柱上观察到 Cy3 标记的 cDNA 产物。如果穿流液呈现鲜亮的粉红色，或柱上无粉红色产物，则表明标记反应可能未正确进行。可使用 NanoDrop ND-1000 分光光度计对标记反应进行定量评估，以测定标记 DNA 的浓度及碱基与染料的比率（图 1）。在本实验室中，标记反应通常可获得至少 10 μg 的标记 DNA。染料掺入量可通过简单的碱基/染料比率计算，其中核苷酸与 Cy3 的比率等于 A₂₆₀/A₅₅₀ 比值乘以 23.15。比值在 50–80 范围内表明标记反应中染料掺入量充足。若标记反应所得 DNA 浓度过低或染料掺入效果不佳，则不建议进行样品在微阵列上的杂交，应重新进行标记反应。

可通过评估微阵列的图像直方图及其扫描图像（图2）来判断杂交质量。可接受的杂交结果应有1-2%的特征点达到饱和（即在65,000的饱和限值下产生1e-5的归一化计数），且PMT值设定在接近500的水平。若为了在65,000饱和限值下达到1e-5的归一化计数，而必须将PMT值从500大幅调整，则通常表明标记的cDNA在微阵列上的杂交效果较差。若继续对这类数据进行后续分析，将会影响数据质量。杂交质量还可通过观察扫描阵列的图像进行定性评估（图3）。罗氏NimbleGen杂交试剂盒包含一组由Cy3和Cy5标记的48碱基寡核苷酸对准探针混合物，可与芯片上的对准特征点发生杂交。通过定性评估这些对准寡核苷酸与其他阵列特征点的信号强度，可对荧光标记cDNA在芯片上的杂交效率进行质量检查。进一步分析后，可利用分析所得数据绘制散点图，以确定基因表达的相对水平，并识别样本间差异表达的基因（图4）。

图1. 用Cy3标记的cDNA的NanoDrop光谱。 可使用NanoDrop ND-1000分光光度计评估标记cDNA的产量和染料掺入情况。请点击此处查看图1的放大版本。

图2. 基因芯片扫描的 GenePix 直方图。 可通过评估图像直方图来判断杂交质量。可接受的杂交结果中，应有1-2%的特征点在65,000的饱和限值处达到饱和，其归一化计数值为1e-5，且PMT值设定在接近500的位置。请点击此处查看图2的放大版本。

图3. 扫描后的微阵列图像。 通过查看微阵列的扫描图像可评估杂交质量。应检查图像中是否存在灰尘或其他干扰因素，这些因素可能妨碍每个特征点的可视化，从而影响特征点荧光强度的准确计算。可通过将定位寡核苷酸的信号强度与阵列上其他特征点进行比较，以评估杂交效率。

图 4. 已分析的微阵列实验的散点图。 本实验的目的是鉴定在样本中差异表达的基因。微阵列数据可进一步分析并以散点图形式展示，以便直观识别差异表达的基因。

表1. 用于杂交步骤2的罗氏NimbleGen杂交试剂盒组分。

组分	体积
样品（溶于水）	5 μl
2X 杂交缓冲液	9 μl
Hyb A	3.6 μl
引物序列（Alignment Oligo）	0.4 μl
总体积	18 μl

表2. 杂交后用于芯片洗涤的洗涤缓冲液。

组分	洗涤缓冲液 IA*	洗涤缓冲液 IB	洗涤缓冲液 II	洗涤缓冲液 III
水	225 ml	225 ml	225 ml	225 ml
10X 洗涤缓冲液 I、II 或 III	25 ml	25 ml	25 ml	25 ml
1 M DTT	25 μl	25 μl	25 μl	25 μl
总体积	250 ml	250 ml	250 ml	250 ml

*预热至 42°C

讨论

许多微阵列实验方案（包括此处详述的方案）均采用荧光染料来检测和定量杂交信号。Cy3荧光染料对光和臭氧降解敏感，因此建议在尽可能弱的光照条件下进行操作。此外，微小的灰尘颗粒可能干扰杂交和扫描过程，应特别注意确保工作区域清洁无尘。

针对本实验步骤中所述的标记方案，存在多种替代方法。建议测试不同的标记方案，以确定适用于每种特定表达微阵列平台的最佳标记程序。此处演示的方案已针对由罗氏NimbleGen公司打印的这一特定表达芯片平台进行了优化。此外，我们发现罗氏NimbleGen芯片用户指南中详述的标记方案同样有效。若将本方案应用于其他表达芯片平台（尤其是其他厂商生产的平台）时，应谨慎行事，因为杂交特性在很大程度上取决于芯片平台的打印方法。

将该表达谱芯片实验方案与我们的RNA提取和cDNA合成方案相结合，在本实验室常规可获得可重复的高质量基因表达谱芯片数据。这对于所有表达谱芯片分析而言均至关重要，因为最终数据的质量最终取决于这些初始步骤的质量。在最终表达谱芯片分析之前的任何一步若未达到最佳效果，都将影响最终数据的质量。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
阵列微型离心干燥仪	ISC Bioexpress	C-1303-T
BioPrime 阵列CGH基因组标记系统	Invitrogen	18095-011
氰基3-dCTP	PerkinElmer, Inc.	NEL576
GenePix 4000B	Molecular Devices	GENEPIX 4000B
Microcon YM-30	EMD Millipore	42411
NimbleGen 阵列处理配件	Roche Group	5223539001
NimbleGen 杂交试剂盒	Roche Group	5223474001
NimbleGen 杂交系统 4	Roche Group	5223652001
NimbleGen 洗涤缓冲液试剂盒	Roche Group	5223504001
X1 混匀器	Roche Group	5223725001