变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（Urea PAGE）

摘要

变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分离单链DNA或RNA，最大可分离长度达500个核苷酸。尿素与加热共同作用使样品变性，未形成结构的单链根据其分子量在凝胶基质中迁移。

摘要

尿素PAGE或变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳采用6-8 M尿素，可使DNA或RNA的二级结构发生变性，并基于分子量在聚丙烯酰胺凝胶基质中实现其分离。该方法可用于分离长度在2至500个碱基之间的片段，甚至可分辨仅相差一个核苷酸的长度差异¹。样品的迁移行为取决于所选用的丙烯酰胺浓度。较高浓度的聚丙烯酰胺可更好地分辨低分子量片段。在电泳过程中结合使用尿素以及45-55 °C的温度，可实现非结构化DNA或RNA分子的分离。

通常，该方法用于分析或纯化单链 DNA 或 RNA 片段，例如合成或标记的寡核苷酸，或酶切反应的产物。

在本视频文章中，我们展示了如何制备和运行变性尿素聚丙烯酰胺凝胶。除原始方案^1,2外，还包括技术提示。

方案

本实验步骤的完整且详细的文本方案可在《分子生物学实验指南》中获取。有关凝胶夹心结构组装及凝胶装置的详细分步说明，可参见 BioRad 网站³。

所需设备：
玻璃板（内板和外板）
10 cm 电泳槽：10.1 × 7.3 cm（内板），10.1 × 8.2 cm（外板），BioRad
20 cm 电泳槽：20 × 20 cm（内板），20 × 22.3 cm（外板），BioRad
0.5–1.5 mm 胶梳和垫片
凝胶制备架
带盖和导线的电泳装置
高压电源
加热块或水浴锅
移液管和移液器辅助装置
移液器和移液器吸头
凝胶干燥器或扫描仪

试剂与溶液：
尿素（超纯）
40% 聚丙烯酰胺溶液（29:1）
10 × TBE 溶液（Tris-硼酸-EDTA 缓冲液）
去离子蒸馏水
TEMED
30% (w/v) 过硫酸铵溶液
0.5 × TBE 溶液
甲酰胺
EDTA
二甲苯腈蓝
溴酚蓝
甲醇
乙醇

讨论

1. 条带的清晰度取决于多个因素。为了获得清晰的条带，上样体积应尽可能小，理想情况下为 1-5 μl。然而，最多可上样至 15 μl，仍可保证可接受的分辨率。较小的上样体积可产生更清晰的条带。
2. 条带质量还与凝胶厚度有关。较薄的凝胶（如 0.75 mm）比 1.5 mm 厚的凝胶效果更好。
3. 在加样过程中，若样品未均匀加入凝胶孔中，也可能影响条带形状。在上样缓冲液中加入 10% 甘油有助于加样操作，使样品更易沉入加样孔内。
4. 另一个可能与上样缓冲液相关的问题是，目标产物的迁移位置可能与其中一种上样染料相同。此外，若使用荧光标记，某些染料可能在相似波长处产生荧光信号。若出现此类情况，可通过去除一种或全部染料来解决。此时建议将含染料的样品上样于空加样孔中作为分子量标准。
5. 电泳开始时采用较低电压也有助于获得更清晰的条带，因为样品可更平缓地进入凝胶前缘，避免因高电压导致加样孔塌陷。使用短时间的低浓度丙烯酰胺浓缩胶（4%）也可达到相似的条带增锐效果。
6. 一个常见问题是凝胶“微笑”现象，这是由于电泳过程中凝胶内部热量分布不均所致。若凝胶未被缓冲液完全包围，可根据所用凝胶系统，在玻璃板上附加金属板以促进热.......