变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（Urea PAGE）

摘要

变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分离单链DNA或RNA，最大可分离长度达500个核苷酸。尿素与加热共同作用使样品变性，未形成结构的单链根据其分子量在凝胶基质中迁移。

摘要

尿素PAGE或变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳采用6-8 M尿素，可使DNA或RNA的二级结构发生变性，并基于分子量在聚丙烯酰胺凝胶基质中实现其分离。该方法可用于分离长度在2至500个碱基之间的片段，甚至可分辨仅相差一个核苷酸的长度差异¹。样品的迁移行为取决于所选用的丙烯酰胺浓度。较高浓度的聚丙烯酰胺可更好地分辨低分子量片段。在电泳过程中结合使用尿素以及45-55 °C的温度，可实现非结构化DNA或RNA分子的分离。

通常，该方法用于分析或纯化单链 DNA 或 RNA 片段，例如合成或标记的寡核苷酸，或酶切反应的产物。

在本视频文章中，我们展示了如何制备和运行变性尿素聚丙烯酰胺凝胶。除原始方案^1,2外，还包括技术提示。

方案

本实验步骤的完整且详细的文本方案可在《分子生物学实验指南》中获取。有关凝胶夹心结构组装及凝胶装置的详细分步说明，可参见 BioRad 网站³。

所需设备：
玻璃板（内板和外板）
10 cm 电泳槽：10.1 × 7.3 cm（内板），10.1 × 8.2 cm（外板），BioRad
20 cm 电泳槽：20 × 20 cm（内板），20 × 22.3 cm（外板），BioRad
0.5–1.5 mm 胶梳和垫片
凝胶制备架
带盖和导线的电泳装置
高压电源
加热块或水浴锅
移液管和移液器辅助装置
移液器和移液器吸头
凝胶干燥器或扫描仪

试剂与溶液：
尿素（超纯）
40% 聚丙烯酰胺溶液（29:1）
10 × TBE 溶液（Tris-硼酸-EDTA 缓冲液）
去离子蒸馏水
TEMED
30% (w/v) 过硫酸铵溶液
0.5 × TBE 溶液
甲酰胺
EDTA
二甲苯腈蓝
溴酚蓝
甲醇
乙醇

体积	50 ml			60 ml			10 ml
丙烯酰胺浓度	10%	12.5%	15%	10%	12.5%	15%	10%	12.5%	15%
g 尿素	24	24	24	28.8	28.8	28.8	4.8	4.8	4.8
ml 40% 丙烯酰胺 (29:1)	12.5	15.625	18.75	15	18.75	22.5	2.5	3.125	3.75
μl 30% APS	166	166	166	199.2	199.2	199.2	33	33	33
μl TEMED	20	20	20	24	24	24	4	4	4
10 x TBE	5	5	5	6	6	6	1	1	1
用去离子蒸馏水定容至相应体积

表1：分离单链寡核苷酸所需不同丙烯酰胺浓度和体积的试剂与溶液

凝胶三明治组装与凝胶制备

1. 根据制造商的说明组装凝胶，并将凝胶固定在凝胶制备室中³。使用0.5–1.5 mm厚的隔片。
2. 根据分子生物学中的现行实验方案或表1所列方法，配制适当的聚丙烯酰胺溶液。对于20 cm × 22 cm × 1.5 mm的变性丙烯酰胺凝胶，60 ml凝胶溶液即可；而对于10.1 cm × 8.2 cm × 1 mm的凝胶，则仅需5 ml凝胶溶液。当预期产物/条带大小相差仅几个碱基时，应使用较大的凝胶，因为较长的凝胶可分辨仅相差一个核苷酸的条带。若预期条带之间的差异超过10个核苷酸，则较小的凝胶即可有效分辨这些片段。根据分离需求选择合适的聚丙烯酰胺浓度：聚丙烯酰胺浓度越高，越有利于分辨低分子量的片段。使用超纯尿素，并与所需量的丙烯酰胺混合。加入TBE缓冲液至凝胶混合液中，使最终浓度为0.5–1 × TBE，并用去离子蒸馏水补足体积。将溶液在微波炉中加热20秒，然后轻轻混匀。对于较大体积的凝胶溶液，重复此步骤直至溶液手感微温。
3. 立即使用移液管和自动移液辅助装置将凝胶溶液注入两块玻璃板之间。避免引入气泡。插入梳子，并让凝胶聚合30–60分钟。

安装电泳装置并预电泳凝胶

1. 将凝胶从制胶室拆下，并根据制造商说明将其组装到电泳装置中³。
2. 用运行缓冲液（0.5–1 × TBE）填充下层缓冲液室，使玻璃板浸入缓冲液中 2–3 cm。用运行缓冲液将上层缓冲液室加至凝胶顶部。
3. 小心移除梳子，并使用移液器和上样枪头用运行缓冲液冲洗加样孔。
4. 安装电泳系统的盖子，并将电缆连接至高压电源。在上样前，需预电泳至少 30 分钟，以使凝胶升温并去除凝胶中残留的尿素。最佳温度应维持在 45–55 °C 之间。避免温度超过 60 °C，否则条带可能弥散或玻璃板可能破裂。预电泳时应选择恒定功率（每块凝胶 15–25 W）。

样品制备

1. 在此期间，准备您的样品。向样品中加入适量的 2 × 上样缓冲液。该上样缓冲液通常含有 90% 甲酰胺、0.5% EDTA、0.1% 二甲苯青和 0.1% 溴酚蓝。
2. 在将样品上样至凝胶之前，必须通过将样品在 70–90 °C 加热数分钟进行热变性处理。

上样并运行凝胶电泳

1. 预运行结束后，取下盖子，并按照之前所述方法彻底冲洗加样孔，因为尿素已渗入凝胶孔中。
2. 加样时应小心地从加样孔底部加入样品，避免产生气泡。未加样的孔需加入上样缓冲液，以保持电泳过程中各孔条件一致。
3. 装上盖子，以恒定功率进行电泳，使凝胶温度维持在55 °C，与预运行条件相同。观察指示染料的迁移情况，直至染料前沿到达凝胶底部。电泳时间取决于所用丙烯酰胺的浓度、缓冲液的离子强度以及凝胶厚度，通常持续2至4小时。
   请密切关注凝胶温度，可使用凝胶温度计在电泳过程中监测温度是否适宜。

处理凝胶

1. 当染料前沿到达凝胶末端时，将凝胶从下层缓冲液槽中取出。移除凝胶并松开夹子，取下间隔片，小心拆开玻璃板。如有必要，切除含有上样孔的凝胶部分。
2. 将凝胶小心转移至含有凝胶固定液的容器中（固定液为相同浓度的TBE缓冲液，加入5-10%甲醇和乙醇）。将凝胶在固定液中浸泡5-10分钟，并更换缓冲液两次。
3. 凝胶现已准备好进行后续处理，可使用真空凝胶干燥仪干燥或直接进行凝胶扫描。

讨论

1. 条带的清晰度取决于多个因素。为了获得清晰的条带，上样体积应尽可能小，理想情况下为 1-5 μl。然而，最多可上样至 15 μl，仍可保证可接受的分辨率。较小的上样体积可产生更清晰的条带。
2. 条带质量还与凝胶厚度有关。较薄的凝胶（如 0.75 mm）比 1.5 mm 厚的凝胶效果更好。
3. 在加样过程中，若样品未均匀加入凝胶孔中，也可能影响条带形状。在上样缓冲液中加入 10% 甘油有助于加样操作，使样品更易沉入加样孔内。
4. 另一个可能与上样缓冲液相关的问题是，目标产物的迁移位置可能与其中一种上样染料相同。此外，若使用荧光标记，某些染料可能在相似波长处产生荧光信号。若出现此类情况，可通过去除一种或全部染料来解决。此时建议将含染料的样品上样于空加样孔中作为分子量标准。
5. 电泳开始时采用较低电压也有助于获得更清晰的条带，因为样品可更平缓地进入凝胶前缘，避免因高电压导致加样孔塌陷。使用短时间的低浓度丙烯酰胺浓缩胶（4%）也可达到相似的条带增锐效果。
6. 一个常见问题是凝胶“微笑”现象，这是由于电泳过程中凝胶内部热量分布不均所致。若凝胶未被缓冲液完全包围，可根据所用凝胶系统，在玻璃板上附加金属板以促进热...