体内成像微棱镜用于深层皮层的成像

摘要

将直角微棱镜插入小鼠新皮层，可实现对多个皮层的深层成像，其视野通常仅在脑片中可见。一毫米微棱镜提供宽广的视野（约900 μm）和足够的空间分辨率，足以分辨树突棘。我们展示了利用微棱镜进行第V层神经元成像和新皮层血管成像的方法。

摘要

我们介绍一种使用微棱镜形状的深部脑成像探针进行活体皮层组织成像的实验方案。微棱镜尺寸为1毫米，其斜边具有反射涂层，可实现激发光和发射光的内反射。该微棱镜探针能够同时对多个皮层层次进行成像，其视角通常仅在脑片制备中可见。图像采集具有较大的视场（约900 μm）。此外，我们提供了非存活手术操作及显微镜设置的详细步骤。代表性结果包括来自Thy-1 YFP-H小鼠的第五层锥体神经元图像，显示其顶端树突穿过浅层皮层并延伸至树突簇。分辨率足以对第五层神经元胞体附近的树突棘进行成像。经尾静脉注射荧光染料可揭示皮层中复杂的血管网络。对毛细血管中流动的红细胞（RBCs）进行线扫描，可获得红细胞的速度和通量速率。这种新型微棱镜探针是一种优雅而强大的新方法，可用于活体可视化深层细胞结构及皮层功能。 关键词：活体成像，微棱镜，皮层，深部脑成像，双光子显微镜，神经元，树突棘，血管网络，红细胞流速，Thy-1 YFP-H小鼠

方案

第一部分：微棱镜光学与显微镜设置

1. 我们使用的微棱镜是来自 Optosigma Corporation 的 BK7 玻璃制成的 1 毫米直角棱镜（图 1）。尽可能使用镊子操作微棱镜。
2. 微棱镜的斜边镀有增强银膜，可在 400 – 2000 nm 范围内提供超过 97% 的反射率。这可实现激光激发光和发射荧光的内部全反射。
3. 尽可能始终使用镊子操作微棱镜。操作时需全程佩戴手套，以保持棱镜清洁。
4. 我们使用自行搭建的双光子显微镜，可用于小型动物成像。将固定在立体定位装置上的动物置于三轴电动载物台上。
5. 显微镜连接至运行 ScanImage 软件的 Windows 电脑。ScanImage 是由 Pologruto 等人¹基于 Matlab 开发的图像采集软件。
6. 在微棱镜成像过程中，我们通常以 1024 × 1024 或 512 × 512 像素的分辨率采集图像。此外，扫描速度通常为每行 2 毫秒或 4 毫秒。
7. 实验中使用两种类型的物镜：
   • 低数值孔径（NA）的干式物镜，用于大视野成像（见试剂与设备表）。
   • 带有玻璃校正环的高数值孔径（NA）干式物镜，可最小化由 0 – 2 毫米厚玻璃引入的球面像差（见试剂与设备表）。
8. 当动物准备在低倍物镜下进行成像时，需将激光的方形光栅扫描模式与微棱镜的顶部对齐。这有助于确定图像方向，并更高效地利用激光功率。
9. 使用带有玻璃校正环的高数值孔径（NA）物镜时，先将校正环设置为校正约 1 毫米厚的玻璃。一旦实验中出现荧光图像，可小心地伸入显微镜内部微调校正环，以最大化成像分辨率。

第二部分：非存活动物手术与微型棱镜植入

1. 整个操作过程的时长，从初始切口到成像完成，取决于实验的具体目标。然而，非存活状态下的手术操作及微棱镜植入通常需要约 30 – 40 分钟完成。
2. 小鼠（P30-P60）称重后，通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行适当麻醉，使其达到适合手术操作的麻醉深度。
3. 在整个实验过程中，应每 15–20 分钟检查一次动物的麻醉水平。若动物对强力脚趾夹捏产生反应，则需追加氯胺酮/赛拉嗪剂量。通常追加剂量为初始剂量的三分之一，可预先配制于注射器中，以便必要时立即进行腹腔注射。
4. 当小鼠达到适当麻醉状态后，使用装有 #40 刀头的剃毛器将其头部大部分毛发剃除。
5. 在头部残留的毛发上涂抹 Nair®，以帮助清除可能在成像过程中干扰微棱镜的毛发。5 分钟后，使用棉签将 Nair® 擦拭干净。
6. 将麻醉后的动物正确固定于小鼠立体定位仪中。在手术操作和成像过程中，动物应置于设定为 36 摄氏度的水循环加热垫上以维持体温。
7. 待动物头部被牢固固定后，使用手术刀沿颅骨中线做一条整齐的切口，以分离皮肤。
8. 将少量 3% 过氧化氢滴于棉签上，并涂抹于颅骨表面，以清除颅骨与皮肤之间的膜状组织。
9. 过氧化氢还有助于显露前囟点（bregma），这是确定开颅位置和微棱镜植入位置的重要解剖标志。
10. 在开始开颅前，应正确调整耳杆和咬合杆，使暴露的颅骨倾斜至基本与操作台面水平。这为开颅提供了更稳定的平台，同时使棱镜的顶面与入射激发光垂直，有助于在成像过程中最小化光学像差。
11. 使用柔性延长臂将小型牙科钻头（约 0.8 mm 钻头尺寸）连接至 Dremel® 工具。进行开颅时，我们将转速设定在约 7,000 至 10,000 转/分钟。
12. 将牙科钻头轻划颅骨表面，直至在骨头上刻出方形凹槽。方形每边长约 2–3 mm，中心位于前囟点后方 1.5 mm、侧方 1 mm 处。
13. 继续磨薄骨片，直至在颅骨上形成一个小孔。随后可用镊子将骨瓣从颅骨上抬起并移除。
14. 在插入微棱镜前必须去除硬脑膜。出血最好通过让血液在表面凝固数分钟来自行控制。之后，在插入微棱镜前，使用外科海绵清除凝固的血液。
15. 为辅助棱镜与皮层的对齐，可将微棱镜的垂直面与镊子的手柄保持平行。
16. 在正确持握棱镜的情况下，将整个微棱镜插入，直至其顶部与新皮层表面齐平。
17. 若插入位置正确，微棱镜应能稳定保持在原位。产生的任何出血量均较小，可用小型外科海绵吸收。一旦棱镜就位，动物即可进行成像。
18. 微棱镜在动物体内使用后可重复使用多次，但必须进行适当清洁以去除残留的生物材料。可通过将棱镜浸入少量盐酸中，随后再浸入甲醇中完成清洁。清洁后的微棱镜可用镜头纸包裹，保存至下次使用。

第3部分：代表性结果

图1： 直角微棱镜的图像。本实验所用的棱镜为一毫米大小的BK7玻璃棱镜，其斜边镀有增强银膜，以实现激发光和发射光的内反射。

图 2： 第V层YFP标记的锥体神经元图像。通过微棱镜进行的宽视野成像揭示了大量位于皮层表面下约800–900 μm深度的锥体细胞胞体。此外，还可分辨出向上延伸至第I层的顶树突。比例尺 = 200 μm。

图3： 采用较高数值孔径的物镜与微棱镜结合，可实现足够的空间分辨率，以分辨第V层锥体神经元顶树突上的树突棘。比例尺 = 10 μm。

图4： 使用微棱镜并通过尾静脉注射荧光染料获得的图像。该图像显示了从深部脑区延伸出的垂直走向的大口径血管，以及在皮层容积中分支出的较细毛细血管。比例尺 = 200 μm。

图5： 使用更高数值孔径的物镜，可更清晰地成像新皮层中的毛细血管网络。比例尺 = 50 μm。

图6： 微棱镜技术还可用于成像流经血管的红细胞（RBCs）。红细胞不吸收荧光染料，因此在血管中呈现为暗色条带。通过在血管横截面上进行线扫描，可获得红细胞通量和流速的测量结果。比例尺 = 10 μm（上、下图中的水平条）和 250 ms（下图中的垂直条）。

讨论

在成像实验中使用微棱镜相对简单，并为新皮层的活体研究提供了诸多优势。采用该技术的代表性示例包括从转基因小鼠中获取的图像，这些小鼠的第V层皮层神经元表达黄色荧光蛋白。利用微棱镜，可以观察到位于皮层表面下近1 mm深处的第V层大量锥体细胞胞体。同时可见的是顶端树突，它们穿过所有浅层后分支形成束状结构（图2）。本实验所用小鼠为转基因动物，其设计仅在第V层神经元中表达YFP（YFP-H²）。结合这些YFP-H小鼠以及带有玻璃校正环的高数值孔径物镜，还可更详细地成像树突结构，并分辨出树突棘（图3）。

也可以采用已建立的尾静脉注射技术，使用荧光素-葡聚糖等荧光染料对皮层血管进行标记。通常情况下，对成年小鼠注射100 µl浓度为20 mg/ml的荧光素-葡聚糖生理盐水溶液较为合适。在将微棱镜插入新皮层后（步骤2.16之后）注射染料可获得最佳效果。利用该技术，可观察到深部皮层中较大管径的血管向软脑膜延伸，并分支形成微毛细血管网络（图4）。使用高数值孔径物镜可更清晰地观察新皮层中这一复杂的微毛细血管网络（图5）。

此外，可...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
增强型银反射涂层-(R77)	OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA)	055-0010	增强型银反射涂层-(R77)
荧光素-葡聚糖	Sigma-Aldrich	FD70	70 kDa
0.28 数值孔径，4x 空气物镜	Olympus Corporation	XLFLUOR 4x/340
0.60 数值孔径，40x 空气物镜	Olympus Corporation	LUCPLFLN	带 0–2 mm 盖玻片校正