在含有 FGF-2 的培养条件下，大鼠晶状体上皮中央区域的外植体可同步分化。对这类培养物进行免疫荧光显微镜观察，可提供有关终末分化过程中基因表达和信号事件的新信息。
本文内容
摘要
摘要
晶状体前表面由单层上皮细胞覆盖，这些细胞在睫状体下方的环形区域增殖。分裂后，这些细胞向后迁移，视网膜扩散的成纤维细胞生长因子（FGF）诱导其分化为一排排伸长的晶状体纤维细胞，后者构成了晶状体的主体部分。在体外，可通过将晶状体前上皮中央区域的组织外植体置于含FGF-2的培养环境中，诱导晶状体上皮细胞向晶状体纤维细胞分化。外植体取自新生大鼠晶状体：首先将晶状体从眼球中取出，用解剖镊夹住晶状体后部的囊膜，轻轻撕开后囊膜，并将其压入组织培养皿的塑料底部。随后用手术刀去除外植体的周边区域，将中央区域置于含100 ng/ml FGF-2的培养条件下培养，培养时间可持续2至3周，具体时长取决于研究参数。由于培养中外植体的上皮细胞在数天至数周内近似同步地分化，因此可利用分子生物学、生物化学及药理学技术测定信号传导和基因表达的时间进程。免疫荧光显微镜技术是这些方法的有力补充，因其可显示目的蛋白的亚细胞定位，并揭示信号通路实验干预后的生理效应。
方案
第1部分：晶状体的摘除
材料与试剂：
- 显微解剖剪，弯曲，钝头（例如：RS-5983，Roboz Surgical Instrument Co., Inc, Gaithersburg, MD）；显微解剖镊，弯头（例如 Roboz #RS5137）。
- 悬浮培养基：含0.1%牛血清白蛋白、100单位/毫升青霉素、100μg/ml链霉素、2.5 μg/ml两性霉素B的199培养基。试剂可从Invitrogen（Carlsbad, CA）获取。
步骤：
- 根据美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院（National Institutes of Health）提供的指南，处死出生后2-4天的新生大鼠。
- 用手术剪剪除眼睑。用弯头镊子轻轻从眼眶两侧相对挤压，使眼球向外突出。用剪刀在眼球后部做一小切口。通过用镊子挤压切口对侧的眼球壁，可使晶状体及少量附着的玻璃体从破裂处挤出，从而可用弯头镊子夹取晶状体。操作时应注意避免破坏晶状体囊膜。
- 用弯头镊子将晶状体转移至含有5 ml温热无菌悬浮培养基的60 mm塑料培养皿中。
第2部分：外植体的显微解剖
材料与试剂：
- 微型解剖镊，尖端宽度0.1 mm（例如 Roboz RS-4976）。我们选用杜莫斯特合金（Dumostar alloy），因其尖端具有良好的柔韧性，但其他钢合金也可接受。不建议使用尖端薄于0.1 mm的镊子，因其在此操作过程中易发生断裂或弯曲。
- 悬浮培养基（见第1部分）
- 未添加补充物的Ham’s F12培养基或Medium 199（Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯伯格）
实验步骤：
- 以下步骤应在洁净、无气流的环境中进行，使用无菌解剖器械和无菌培养基。
- 在体视解剖显微镜下，用0.1 mm尖头镊子清除晶状体表面附着的组织，并将其转移至第二个含有5 ml无菌悬浮培养基的60 mm培养皿中（此步骤有助于减少污染）。随后，用镊子将所需数量的晶状体转移至一个含有5 ml无菌未添加物培养基的35 mm培养皿中。（我们通常在此步骤中使用Ham’s F12培养基（Invitrogen），因为其染料浓度较低，便于解剖操作；但Medium 199也可接受。此步骤无需添加抗生素或其他成分。）最多可在该规格培养皿中央制备12个组织块。然而，即使制备较少数量的组织块，也应使用35 mm培养皿，因为在更小的培养皿中难以操作解剖工具。将盛有剩余晶状体的培养皿转移至37°C组织培养孵育箱中，待后续使用。
- 确定晶状体的后侧。可通过多种方式识别：1）后侧比前侧更圆，前侧略扁平；2）新生大鼠晶状体在解剖过程中冷却至室温时会形成冷性白内障。若白内障尚未完全充满晶状体，则后侧为距离混浊区域最远的一侧。若混浊已充满晶状体，可将培养皿在37°C下温育数分钟以逆转白内障。当重新冷却时，白内障首先形成的一侧即为后侧。3）后侧可能可见晶状体血管膜（tunica vasculosa lentis）的残余结构。4）后侧可能可见晶状体后缝。正确识别后侧至关重要，因为晶状体囊膜的切口将在此处打开。若在前侧切开晶状体，会导致上皮层撕裂。
- 确定后侧后，将其朝上翻转，并用左手镊子夹住晶状体（适用于右利手操作者）。然后用右手镊子夹住后囊膜，使其产生一个小褶皱。
- 在用右手镊子固定后囊膜的同时，用左手镊子夹住囊膜褶皱，将两把镊子向相反方向拉动，从而在囊膜上制造一个小撕裂口。
- 用镊子夹住回缩的囊膜边缘，先在一侧向下拉动，并用镊子将其压入培养皿的塑料表面，再在另一侧重复此操作。围绕晶状体赤道部反复进行数次，直至囊膜在多个点牢固附着于培养皿底部。用左手镊子固定囊膜，同时用右手镊子轻轻摇动纤维团块，以破坏晶状体赤道部纤维细胞与上皮细胞之间的连接。然后将纤维团块推离，使其从仍附着于培养皿底部的囊膜/上皮层上滚落。对培养皿中的所有晶状体重复此过程。移除并丢弃纤维团块（或将其冷冻保存，作为其他研究中晶状体蛋白的来源）。
第3部分：中枢外植体的显微解剖与培养
材料与试剂：
- 无菌一次性手术刀，#15 刀片，（Cincinnati Surgical Co. Cincinnati, OH）
- 含钙和镁的无菌磷酸盐缓冲液（Invitrogen, Carlsbad, CA）
- 培养基：含有 100 ng/ml FGF-2 的悬浮培养基（Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO）
步骤：
- 使用无菌手术刀切除周边上皮（PE），该区域含有处于早期分化阶段的细胞（图 1A），保留一个边长约 2.0 mm 的中央方形区域，该区域仅由中央上皮细胞（CE）组成（图 1B）。
- 将含有中央外植体的培养皿转移至生物安全柜中。用含钙和镁的无菌 PBS 洗涤 3 次，再用 1 ml 新鲜、已平衡（37°C，5% CO2）的悬浮培养基洗涤 1 次。这些洗涤步骤可显著降低污染风险。
- 加入 2 mL 诱导分化培养基1，并将外植体置于 37°C、5% CO2 的湿化组织培养孵育箱中。培养时间可根据所研究的参数短至数小时，或长至两到三周。培养基应每两到三天更换一次。
第4部分：收获外植体以分析与分化相关的事件
1. 收集外植体用于蛋白质或RNA分析
材料：
- 显微解剖镊
- SDS裂解缓冲液或RNA-later
实验步骤：
- 孵育期结束后，移除培养基。
- 使用体视解剖显微镜，轻轻松动每个外植体的边缘。
- 用镊子提起每个外植体，并转移至含有约100μl SDS裂解缓冲液（用于蛋白质分析）或RNA-later（用于RNA分析）的离心管中。将镊子尖端在溶液中轻轻搅动，以确保外植体已脱离镊子。
2. 用于免疫荧光的外植体收获
材料与试剂：
- 含钙和镁的磷酸盐缓冲液（Invitrogen，Carlsbad，CA）
- 不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（Invitrogen，Carlsbad，CA）
- 4% 多聚甲醛（Boston Bioproducts，Worcester，MA）
- 显微解剖镊子
- 疏水性标记笔
- 玻璃显微镜载玻片
- 含0.25% Triton X-100的磷酸盐缓冲液
实验步骤：
- 用含有钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）短暂冲洗组织块。
- 加入4%多聚甲醛，在室温下固定组织30分钟。
- 移除固定液，更换为磷酸盐缓冲液。固定后的组织块会略微变硬，便于将其提起并转移至玻片上进行免疫染色。
- 在玻片上滴加少量不含钙和镁的PBS，以帮助定位组织并防止卷曲。使用显微解剖镊子将组织块提起，并将其置入玻片上的液滴中。在不接触组织块的情况下，用滤纸小心吸去液体，使组织块在玻片上展平，然后在室温下空气中干燥3至5分钟。
图1 A. 外周上皮表达分化特异性蛋白。所示的组织块在显微解剖后立即进行N-钙黏蛋白免疫染色。在外周上皮的一条细胞带中可见表达，表明该区域的细胞已开始分化。B. 可将外周上皮修剪去除，以清除表达N-钙黏蛋白及其他分化特异性蛋白的细胞。红色环形代表表达N-钙黏蛋白的细胞所在位置，而灰色轮廓的小方块代表图1A中所示的上皮象限。通过四次手术刀切割可去除外周上皮，留下一个仅包含尚未开始分化细胞的中央方块。
讨论
大鼠晶状体外植体系统已被多家实验室成功用于研究晶状体上皮细胞向晶状体纤维终末分化的过程21,3,4,5。当暴露于100 ng/ml的FGF-2时，外植体在数分钟内即开始出现信号通路的变化6，形态学改变和基因表达变化则在随后的数天内依次出现3,4,5。若注意防止污染，培养物可保持活力达2-3周。
本方案中所述的中央外植体特别适用于研究与分化相关的事件序列，因为在外植体中，在添加 FGF-2 之前几乎不含或完全不含表达分化标志物的细胞1,5。随后，细胞会以群体同步分化，从而可追踪与分化相关的信号转导和转录事件的时间进程。因此，将外植体培养不同时间长度，可提供关于事件序列的精确时间信息。可在培养基中加入特异性抑制剂，以鉴定相关信号通路。外植体可用于通过 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析蛋白质表达，或通过 RT-PCR 分析特定 mRNA 的表达。每个外植体的蛋白产量为 20–50 μg，RNA 产量约为 200–600 ng/外植体，具体产量取决于培养时间的长短。我们通常发现，每培养皿使用 5–6 个外植体即可为多项检测提供足够的蛋白或 RNA。外植体提取的 RNA 还可用于制备 cDNA，进而通过基因芯片分析评估基因表达，从而识别可能对分化至关重要的新基因。外植体也可进行转染。尽管转染效率通常较低，但足以用于报告基因的检测4;7;8。对外植体进行免疫荧光显微镜观察，可确定目的蛋白的亚细胞定位，是对生化方法的有力补充。因此，大鼠晶状体外植体的制备与培养为研究哺乳动物晶状体终末分化提供了一个强大的体系，可与体内技术（如转基因小鼠和基因敲除小鼠的构建）相互补充。
致谢
晶状体上皮外植体的制备方法借鉴自John McAvoy博士实验室建立的技术9。本研究由国家眼科研究所院内研究计划（项目编号：Z01-EY000238-22）资助
参考文献
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