本文描述了进行LIPS（荧光素酶免疫沉淀系统）的技术细节。总体方法包括在哺乳动物细胞中表达编码抗原与海肾荧光素酶（Ruc）融合的嵌合基因。随后制备粗制的Ruc-抗原提取物，并在无需纯化的条件下直接用于免疫沉淀测定，以定量抗体。
本文内容
摘要
摘要
全面理解并定量分析针对自身抗原及病原体的抗体谱的技术，可能为疾病机制提供新的见解，并有助于阐明可用于区分具有不同临床特征的疾病亚型的新标志物，从而更深入地理解发病机制。我们开发了一种高通量定量方法，称为荧光素酶免疫沉淀系统（Luciferase Immunoprecipitation Systems, LIPS），用于分析患者血清对自身抗原以及感染相关病原体抗原的抗体反应谱。与ELISA不同，LIPS具有高度敏感性，可采用通用格式轻松实现对不同抗原的体液血清学反应谱的检测，并能产生高达6个数量级的动态抗体滴度范围。10对于某些抗原而言，这些研究中利用LIPS技术对患者体液免疫应答进行定量分析，所针对的抗原组合甚至包括某些病原体（如HIV）的整个蛋白质组，通常比ELISA法仅检测单一抗原提供更丰富的信息。此外，LIPS技术还省去了制备高纯度抗原所需的时间和精力，也避免了传统ELISA中繁琐的实验条件优化步骤。本文提供了一份详细的实验方案，描述了如何开展LIPS检测，以便捷地分析针对单一或多种抗原的抗体应答。
方案
1. 示意图概述：
本视频展示了进行LIPS检测的步骤。抗原在Cos1细胞中以重组形式表达 海肾 荧光素酶（Ruc）-抗原融合蛋白，并获取粗提物直接使用，无需纯化。LIPS 检测通过将粗提物孵育来启动。e Ruc-抗原 在微量滴定板孔中用患者血清进行孵育。然后将抗体-抗原混合物转移至含有蛋白A/G磁珠的96孔滤板中，以捕获IgG分子。洗涤含有蛋白A/G磁珠的滤板后，加入腔肠素底物，通过发光仪检测结合抗体的Ruc-抗原所产生的光信号单位。
第一部分：转染编码Renilla-抗原融合蛋白的质粒
实验准备：使用标准的组织培养方案，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养Cos1细胞。Renilla荧光素酶融合蛋白表达质粒此前已有描述1。使用Qiagen公司的中量质粒提取试剂盒制备这些质粒的DNA，产量应约为1–3 mg。测定DNA浓度，并将其配制成1000 μg/ml的储存液，于-20°C保存。
实验步骤：
- 转染前一天，将 Cos-1 细胞以每皿约 2 × 106 个的密度接种至新的 100 × 20 mm 培养皿中，于 37 °C 培养。
- 次日，Cos-1 细胞应达到 80–95% 的融合度。为每种待转染的质粒 DNA 标记相应的 1.5 ml 聚丙烯微量离心管，并将储存于 4 °C 的 FuGENE-6 转染试剂置于室温回温。
- 向每支微量离心管中加入 94 μl Opti-MEM 培养基，然后加入 6 μl FuGENE 6，注意避免接触管壁。
- 将混合物在室温下孵育 5 分钟。
- 加入 1–2 μg（来自 1 mg/ml DNA 储液）的 Renilla 荧光素酶抗原融合表达质粒，混匀后于室温孵育 15 分钟。
- 将 DNA-FuGENE 6-Opti-MEM 混合液均匀滴加至 Cos-1 细胞培养皿的培养基中，完成转染。
第二部分：收获Renilla-抗原融合蛋白
- 转染后两天，收集 Cos-1 细胞。首先移除培养基，然后用 6 ml PBS 洗涤细胞。倾去 PBS 后，用移液器吸除组织培养皿中残留的 PBS。
- 加入 1.4 ml 冷裂解缓冲液，缓冲液成分为 50 mM Tris（pH 7.5）、100 mM NaCl、5 mM MgCl2、1% Triton X-100、50% 甘油以及蛋白酶抑制剂（每 50 ml 裂解缓冲液中加入 2 片 complete miniprotease inhibitor cocktail）。用细胞刮刀收集细胞，并迅速将裂解液的一半分别转移至两个预冷的 1.5 ml 微量离心管中，置于冰上。
- 使用 Branson Sonifier 150 超声破碎细胞。将含有细胞裂解液的微量离心管置于冰上，依次以超声设置 2、2 和 4 进行三次 5 秒脉冲，每次间隔 5 秒。
- 在 4 °C 条件下，以 12,500 RPM 离心两次，每次 4 分钟。第一次离心后，轻柔倒置离心管，以去除管壁上松散附着的碎片。第二次离心后，小心地将上清液（避免扰动沉淀）从两个离心管转移至一个新的预冷微量离心管中。
- 计算每微升（μl）裂解液的光单位（LU）。为测定 LU，取 1 μl 裂解液加入 8 μl PBS，在新的微量离心管中稀释。直接向稀释后的混合液中加入 100 μl 1X 腔肠素底物，并立即使用管式发光仪（20/20n Turner Scientific）测量发光信号，读数时间为 5 秒。
- Ruc-抗原裂解液可在 -20 °C 保存 1–2 天，或分装后于 -80 °C 长期保存。
第3部分：制备血清主板
- 制备血清主板：首先向96深孔聚丙烯微孔板的每个孔中加入450 μl缓冲液A（50 mM Tris，pH 7.5，100 mM NaCl，5 mM MgCl2，1% Triton X-100）。在此步骤中，也可在缓冲液A中加入染料酚红（Phenol Red）（终浓度为0.2 μg/ml），作为示踪剂以监测后续血清样本的添加及其他LIPS实验步骤。
- 接着，向含有450 μl缓冲液A的不同孔中分别加入各样本的50 μl血清。注意，此步骤实现了血清在缓冲液A中的1:10稀释。通常，主板最后两孔不加血清，以保留作为空白缓冲对照。
- 使用主板前，需将其置于旋转摇床上充分振荡1–2小时。若妥善保存以防止蒸发，主板中的血清在4°C下至少可稳定保存1个月（或更长时间）。
- 如下所述，该主板可多次取出10 μl稀释后的血清，用于针对多种抗原的血清谱型分析。也可使用更大或更小规格的主板。当主板不使用时，应用Parafilm封膜密封。
第4部分：LIPS检测
- 使用聚丙烯96孔浅孔微孔板检测血清。第一步，使用8通道移液器将40 μl缓冲液A加入96孔板的每个孔中。
- 接下来，从主板中取出10 μl稀释后的血清（相当于1 μl原血清），使用8通道移液器直接加入工作板的每个孔中。
- 随后配制含有Ruc-抗原提取物的主混合液，使每孔加入50 μl缓冲液A中含有1 × 107发光单位（LU）。较低的加入量（低至1 × 106）也可使用，但会导致动态范围降低。配制该主混合液后，用移液器向每孔加入50 μl Ruc-抗原混合液。
- 将微孔板置于旋转摇床上，室温孵育1小时。
- 在孵育期间，向一个新的96孔滤板HTS板（Millipore，Bedford，MA）的每个孔底部加入5 μl PBS中30%的Ultralink蛋白A/G磁珠悬浮液（Pierce Biotechnology，Rockford，IL）。
- 1小时孵育结束后，使用8通道移液器将100 μl Ruc-抗原-抗体反应混合物转移至含有蛋白A/G磁珠的96孔滤板HTS板中。
- 将96孔滤板置于旋转摇床上，室温再孵育1小时。
- 随后在真空 manifold 上洗涤滤板。每个孔用100 μl缓冲液A洗涤8次，再用100 μl PBS洗涤2次。该步骤可手动操作，也可使用机器人移液工作站完成。
- 最后一次洗涤后，关闭真空。取下滤板，用一叠纸巾或滤纸吸干，确保去除板的顶部和底部的水分。
第5部分：发光检测与数据分析
设置：
使用配备单通道注射器的Berthold LB 960 Centro微孔板发光仪测定每个孔的发光值。仪器开机后，使用注射器清洗程序以蒸馏H2O冲洗注射器。腔肠素底物按照生产商说明，使用Promega海肾荧光素酶底物试剂盒配制。通常配制6 ml的1X腔肠素底物混合液（即60 μl腔肠素储存液加6 ml 1X缓冲液），用于仪器引管及运行一块完整的96孔板。在分析微孔板前，需先用1X腔肠素底物对Berthold LB 960 Centro微孔板发光仪进行引管。打开包含底物注射和读板参数的程序文件。在这些测定中，注入50 μl腔肠素底物，随后震荡2秒，接着进行5秒的发光信号读取。
- 尽管平板发光仪能够读取整块板，但也可选择部分读取（在读取菜单下）。启动程序，开始对平板进行读取。
- 运行结束后，应及时取出微量滤板，防止发光仪内发生溢洒。使用MikroWin程序将生成的数据导出为Excel格式以进行分析。
- 我们建议对血清样本进行两次独立实验。然后对数据取平均值，以获得每个样本的LU滴度值。这些数值还可进一步校正，扣除缓冲液空白值。
- 其他数据分析，例如确定临界值，可通过对照值的平均值加3或5倍标准差来计算。
讨论
LIPS 所需的实验优化极少，由于其操作简便，通常可在两周内针对任意抗原使用 LIPS 生成高质量数据。最耗时的步骤是克隆并构建含有 Ruc-抗原融合蛋白的适当质粒表达载体。一旦获得这些质粒，即可如上所述快速对单个或多个抗原进行 LIPS 检测。需要注意的是，LIPS 具有很高的灵活性，血清样本既可在离心管中检测，也可借助 BIOMEK 机器人工作站2 或配备真空过滤装置的洗板机在微量滤板上进行检测。这一高度可扩展的系统可实现对一组人类自身抗原3 或病毒全蛋白质组4 的并行 LIPS 分析。LIPS 生成的多种不同抗体谱很可能在诊断3-9、抗原发现9、治疗过程监测10、疫苗效果监控等方面具有重要价值，并对特定疾病状态及公共卫生总体具有广泛意义。
致谢
本研究由美国国家牙科与颅面研究所（NIDCR）院内研究计划资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| HiSpeed 质粒中量提取试剂盒 | Qiagen | 12643 | |
| 100 × 20 mm 组织培养皿 | Fisher Scientific | 353003 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985 | |
| FuGENE 6 | Roche Group | 1814443 | |
| Complete, Mini 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche Group | 11836153001 | |
| 聚丙烯 96 孔深孔板，1 ml | Fisher Scientific | 12-566-120 | 带盖深孔板，并用 Parafilm 封膜密封 |
| 聚丙烯微量滴定板 | Fisher Scientific | 12-566-120 | |
| HTS 滤膜板 | EMD Millipore | MSBVN1B50 | |
| UltraLink 固相化 Protein A/G | Pierce, Thermo Scientific | 53133 (10ml) | |
| 海肾荧光素酶检测系统 | Promega Corp. | E2820 | 适用于 2000 次检测 |
| Centro 微孔板发光仪 | Berthold Technologies | LB 960 |
参考文献
- Burbelo, P. D., Goldman, R., Mattson, T. L. A simplified immunoprecipitation method for quantitatively measuring antibody responses in clinical sera samples by using mammalian-produced Renilla luciferase-antigen fusion proteins. BMC Biotechnol. 5, 22-22 (2005).
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- Burbelo, P. D. Sensitive and robust luminescent profiling of anti-La and other autoantibodies in Sj gren’s syndrome. Autoimmunity. 139, 241-245 (2009).
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- Burbelo, P. D., Groot, S., Dalakas, M. C., Iadarola, M. J. High definition profiling of autoantibodies to glutamic acid decarboxylases GAD65/GAD67 in stiff-person syndrome. Biochem Biophys Res Commun. 366, 1-7 (2008).
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- Ramanathan, R. A luciferase immunoprecipitation systems assay enhances the sensitivity and specificity of diagnosis of Strongyloides stercoralis infection. J Infect Dis. 198, 444-451 (2008).
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