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用于组织工程的三维水凝胶细胞包封

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DOI：

10.3791/1590

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2009年10月26日

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1Department of Bioengineering, University of Pennsylvania , 2Department of Bioengineering, University of Pennsylvania-School of Medicine

本文内容

摘要

我们介绍了将细胞包封于合成水凝胶中的三维（3D）技术方案。文中概述了两种常用的交联方法（迈克尔加成反应和光引发自由基反应）的包封步骤，以及多种用于评估包封后细胞行为的技术。

摘要

细胞在水凝胶中的三维包封技术正日益成为细胞培养及组织工程构建体开发的重要且广泛应用的方法。该环境能更真实地模拟细胞在体内所处的微环境 体内 与标准的组织培养相比，由于具有类似组织的特性和三维环境，合成聚合物水凝胶是一种吸水膨胀的网络结构，可被设计为稳定存在，或通过水解或蛋白酶解方式降解，从而伴随包封细胞沉积新组织。已有多种聚合物被探索用于此类应用，例如聚乙二醇（poly(ethylene glycol)）和透明质酸（hyaluronic acid）。通常情况下，聚合物会被修饰上甲基丙烯酸酯或丙烯酸酯等可反应基团，使其能够通过多种机制发生交联。在过去十年中，通过物理方式或侧链共价结合生化信号分子等手段对这些微环境的工程化已取得显著进展，以提高细胞存活率并调控细胞表型，包括引导包封的干细胞分化（Burdick 等).

我们实验室及其他实验室已对以下细胞三维包封方法进行了优化，以最大程度提高细胞相容性，并减少水凝胶制备步骤。在以下实验方案中（实验流程示意图见图1），假设已具备可发生交联反应的功能化聚合物；有关聚合物化学在组织工程领域中的应用，可参考其他优秀综述（Burdick et al.），且这些方法适用于多种类型的聚合物。此外，本文重点介绍的迈克尔加成反应（参见 Lutolf et al.）和光引发自由基交联反应（参见 Elisseeff et al.）仅占已报道交联技术中的一小部分。混合模式交联是一种常用且有效的策略，即先通过加成反应消耗部分反应性基团，再通过自由基机制完成交联，可用于调控包封细胞的表型（Khetan et al., Salinas et al.）。

方案

A. 材料准备与灭菌

  1. 在准备包封材料之前，先配制质量分数为 0.5% 的光引发剂 Irgacure 2959（I2959）在磷酸盐缓冲液（PBS）中的溶液，通过混合并在 37°C 下孵育数天完成。随后可通过注射器滤器过滤该溶液以实现灭菌，并在室温下长期保存备用。
  2. 根据拟合成水凝胶的所需组成，使用 Microsoft Excel 等电子表格程序计算所需聚合物和交联剂的质量。由于需将特定质量的聚合物溶解于确定的总体积中，以达到水凝胶中目标浓度，因此必须通过电子表格同时确定交联剂和聚合物溶液在总凝胶体积中所占部分。若拟在交联前引入任何侧链官能团（例如含有黏附性 RGD 或 YGSR 的寡肽），也应进行类似的计算。
  3. 称取所需量的聚合物和交联剂，并放入 Eppendorf 管中。根据实际称得的聚合物质量，相应调整电子表格中的计算值。（注意：可通过调整体积来补偿实际获得的聚合物和交联剂质量的差异）。
  4. 通过使用剃刀刀片切除单个独立包装的无菌 1 mL 一次性注射器的顶部，制备凝胶模具。对于用于光图案化凝胶的模具，应确保切割面平整。
  5. 将注射器模具、Eppendorf 管（管盖打开）以及任何其他必要材料置于杀菌光源下（通常集成于生物安全柜内），进行 30 分钟的灭菌处理。

B. 细胞制备

  1. 灭菌后，向聚合物离心管中加入适当体积的无菌缓冲液（根据电子表格计算结果；缓冲液的选择可有所不同，通常 PBS 用于自由基交联，而三乙醇胺等弱碱性缓冲液用于迈克尔加成交联），并加入（可选）需引入的侧链基团（如黏附性肽），涡旋混匀以溶解（若在无菌操作台外进行涡旋，需用封口膜包裹离心管）。
  2. 将适量的侧链基团溶液加入聚合物溶液中，并用封口膜密封管口。短暂涡旋后，在细胞准备期间于 37°C 孵育以进行反应（如有可能，置于旋转搅拌台上）。该过程涉及肽链上的巯基（通过半胱氨酸基团）与丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯发生反应，从而使肽作为侧链基团整合到最终的水凝胶中。
  3. 用胰蛋白酶消化并计数细胞，按每组凝胶所需数量分装至离心管中。例如，若制备三份 50 μL、细胞密度为 1000 万细胞/mL 的凝胶，则将 150 万细胞分装至单个锥形管中。建议每组凝胶不超过 4 个，以避免凝胶化时间过短而影响操作（注意：若需制备多组凝胶，可预先配制一个含有足量聚合物溶液的离心管供所有组使用）。
  4. 离心细胞。
  5. 在细胞离心过程中：
    1. 光引发自由基交联：向聚合物溶液中加入终体积 10% 的 0.5 wt% I2959 溶液（使引发剂终浓度为 0.05 wt%）。
    2. 迈克尔加成（加成）交联：将缓冲液加入交联剂中，配制成所需浓度的溶液。
    3. 对于顺序交联：此类凝胶同时包含两种交联方式，需执行上述两个步骤。

C. 水凝胶的形成

  1. 吸除离心后细胞部分的上清液。初次吸除后等待液体沉降，再次吸除以尽可能去除培养基，同时避免扰动细胞沉淀。
  2. 用聚合物溶液重悬细胞沉淀，直至细胞均匀分散。通过缓慢吹打溶液（上下吹打约10次即可充分分散细胞）以尽量减少气泡产生。
  3. 水凝胶交联
    1. 光引发自由基交联：将适量体积分装至注射器尖端模具中。将注射器暴露于紫外光下进行自由基交联（例如，对于丙烯酸酯功能化的聚合物，通常采用365 nm、4 mW/cm²的紫外光照射10分钟）。此步骤应迅速完成，以尽量减少细胞在紫外照射前的沉降。
    2. 迈克尔型（加成）交联：使用宽口移液枪头，向聚合物/细胞溶液中加入适量交联剂溶液，将移液器设定为所需单个凝胶体积，吹打混合均匀后分装至注射器尖端模具中。此步骤应迅速操作，以确保细胞分布均匀。在培养罩内孵育10–30分钟（根据具体体系而定），完成交联反应。
    3. 顺序交联：先进行迈克尔加成反应，再通过光照实现第二次交联。第一次交联时仅应反应部分理论交联位点，随后使用无菌镊子将无菌掩膜直接贴附于凝胶表面，再进行光照。此外，可在初始溶液中加入功能化染料（例如，终浓度为20 nM的甲基丙烯酰化罗丹明（MeRho）），以便观察图案化结果，因为该染料会优先掺入凝胶中发生自由基交联的区域（图2）。

D. 细胞培养与分析

  1. 交联后，将凝胶浸入含有培养基的细胞培养板孔中，用于后续孵育和分析（见后续步骤）。
  2. 可通过光学显微镜观察细胞形态（图3；通常合成的水凝胶是透明的），并通过荧光活/死染色试剂盒评估细胞活力（图3和图4）。此外，可按照以下步骤，采用标准的固定和通透化方法对细胞骨架肌动蛋白（如罗丹明或荧光素标记的鬼笔环肽）和细胞核（如4’-6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI））进行染色：
    1. 用 PBS 清洗构建物 3 次，每次 5 分钟。
    2. 在 1 mL 4% 多聚甲醛中室温孵育 30 分钟以固定凝胶。
    3. 用含 3% (w/v) BSA 和 0.5% (w/v) Tween 的 PBS 封闭液清洗构建物 3 次。
    4. 用含 0.25% (w/v) Triton X 的封闭液在室温下通透膜 20 分钟。
    5. 用封闭液清洗构建物 3 次。
    6. 在封闭液中加入 0.66 μg/mL FITC 或罗丹明标记的鬼笔环肽，室温避光孵育 2 小时以染色 F-肌动蛋白。
    7. 用封闭液清洗 3 次。
    8. 在 PBS 中加入 0.4 μL/mL DAPI，室温染色细胞核 20 分钟。
    9. 用 PBS 清洗 3 次。
    10. 使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜观察细胞。
  3. 通常使用市售检测试剂盒（如总 DNA 或生化含量测定）评估凝胶内细胞的增殖情况。PicoGreen 是一种常用且灵敏的荧光核酸染料，可用于定量双链 DNA（Singer et al.）。也可通过第 2 步所述的可视化方法对细胞进行计数，并归一化至初始对照组细胞数量。
  4. 组织学切片与染色也可用于观察细胞及形成的基质。以下为 3D 水凝胶脱水与切片的方案，可用于在载玻片上获得横截面切片：
    1. 固定与脱水
      1. 用 PBS 清洗样品 3 次。
      2. 在 4% 多聚甲醛中固定 5–30 分钟。
      3. 用 PBS 清洗样品 3 次。
      4. 将样品在 25°C 下依次置于下列体积比的乙醇水溶液中（顺序）：50%、70%、95%、95%、100%，每种浓度孵育 1 小时（此时样品可在 25°C 下保存过夜）。
    2. 透明与浸蜡
      1. 转移至 100% Citrisolv 中，25°C 孵育 1 小时，随后在 65°C 孵育 1 小时。
      2. 在培养皿中用剃刀片将样品切成两半，使横截面暴露。
      3. 转移至 Citrisolv/ Micro-cut Paraffin 混合液（1:1）中，65°C 孵育 1 小时。
      4. 转移至 100% Micro-cut Paraffin 中，65°C 孵育 1 小时。
      5. 转移至 100% Micro-cut Paraffin 中，65°C 过夜孵育。
      6. 再次转移至 100% Micro-cut Paraffin 中，65°C 孵育 1–2 小时。
    3. 包埋
      1. 将样品置于剥离模具中，加入 100% 石蜡。
      2. 在模具底部加入少量石蜡，将样品的两个半片横截面向下插入模具中。
      3. 安装顶部滤片
        1. 加入额外石蜡以完全浸没顶部滤片，静置约 10 分钟使其凝固。
      4. 将模具转移至 4°C 冰箱中，使样品过夜固化。
      5. 次日可对样品进行切片，通常使用市售切片机，每片厚度为 5–10 μm。通常将剥离模具垂直固定于切片机载物台上，并通过手动控制调节切片厚度、切割速度及样品与刀片的对齐。
    4. RNA 提取

      基因表达也可通过定量方法进行评估（如实时聚合酶链式反应（PCR））。从 3D 水凝胶中提取 RNA 的方案与更简单的二维情况有很大不同，以下为一个示例方案：
      1. 为每个 3D 水凝胶标记一个经认证的无 RNA 酶的 Eppendorf 管，并向每管中加入 500 μL Trizol® 试剂。
      2. 使用研杵（组织研磨器）手动研磨水凝胶，直至形成澄清溶液。确保不同实验组使用不同的研磨器。
      3. 将每个 Eppendorf 管涡旋振荡 20 秒以均质化样品。
      4. 室温孵育 5 分钟，使核蛋白复合物充分解离。
      5. 将样品置于冰上冷却 20 分钟。
      6. 向每个样品中加入 200 μL 氯仿（每 mL Trizol 加 200 μL），并涡旋振荡。
      7. 室温孵育 5 分钟。
      8. 在 4°C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟。
      9. 将水相（上层透明液体）转移至新的 Eppendorf 管中（避免界面区域及下层红色的酚-氯仿相）。RNA 保留在透明的水相中。
      10. 此后可采用常规的 RNA 分离与保存技术。
      11. RNA 提取后，通常使用市售的逆转录酶和实时 PCR 试剂盒进行后续分析，但需进行部分优化（Elisseff et al., Strehin et al.）。

代表性结果：

有关光图案化水凝胶的可视化及细胞在凝胶内包封的代表性结果，请参见图2-4（见上述实验方案中引用）。

细胞制备流程图，显示材料准备、网络形成和分析方法。
图1. 三维包埋实验流程概览。图中所示步骤与分步操作规程中的章节标题相对应。

使用紫外光、光掩膜和染料进行光化学水凝胶合成；显微图像显示图案。
图 2. 通过依次进行迈克尔加成反应和自由基聚合制备的光图案化水凝胶。（A）部分交联水凝胶结合光敏染料进行光图案化的示意图。（B）圆形或（C）条形透明薄膜掩膜图案化的透明质酸水凝胶。甲基丙烯酸化罗丹明（MeRho）仅掺入暴露于光照区域的凝胶部分。比例尺 = 100 μm。

细胞观察显微镜图像；相差显微镜图像 (A)，荧光标记 (B) 用于细胞分析。
图3. 三维水凝胶中细胞的可视化。干细胞通过 (a) 光学显微镜或 (b) 活细胞（绿色，Calcein AM）与死细胞（红色，Ethidium homodimer-1）染色进行观察，在透明质酸水凝胶中以每毫升100万细胞的密度包封后24小时成像，该水凝胶通过光引发自由基机制交联。比例尺 = 100 μm。

细胞骨架的荧光显微镜图像；肌动蛋白丝（A），合并染色（B）
图4. 三维水凝胶中细胞的可视化。人骨髓间充质干细胞（hMSCs）在包封后第五天进行染色，包封条件为每毫升100万个细胞，包埋于通过迈克尔加成反应交联的透明质酸水凝胶中（使用悬挂的黏附性肽和双功能蛋白酶可降解肽作为交联剂），染色包括（a）活细胞（Calcein AM）或（b）细胞肌动蛋白（罗丹明标记的鬼笔环肽）和细胞核（DAPI）。比例尺 = 100 μm。

讨论

所描述的实验方案代表了一种简单而高效的方法，可将细胞以细胞相容的方式包封于水凝胶支架中。这类技术尤为重要，因为终末分化的细胞和干细胞在二维与三维微环境中的行为表现可能存在显著差异。即使是在涉及材料植入的治疗策略中（例如， 原位 自由基聚合）、细胞包封以及对细胞活力和分化进行分析，有助于材料开发过程。所述的顺序化过程可用于对水凝胶环境进行空间调控，从而调控细胞行为（参见 Khetan 等).

总体而言，所述实验方案中最关键的要素是所用溶液的均一性。尤其需要注意确保细胞在预聚物溶液中均匀分布，并在加入交联剂溶液后通过移液重悬使溶液充分混匀。若未做到这一点，可能导致细胞聚集或凝胶结构与溶胀程度出现局部差异。

尽管本文介绍的实验方案主要侧重于细胞包封的操作步骤，但需要注意的是，包封过程可能需要对通常用于二维培养的分析方案进行一些调整。文中举例说明了在水凝胶中对细胞进行可视化和评估的多种方法。

致谢

本工作获得了国家科学基金会研究生研究奖学金（授予 SK）以及美国国立卫生研究院资助项目 R01EB008722 的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
I2959试剂Ciba Specialty Chemicals
0.2 M 三乙醇胺缓冲液试剂Sigma-AldrichT0449
PBS试剂Invitrogen14040-1171×，无菌液体
活/死细胞染色试剂盒试剂InvitrogenL3224包含活细胞探针（Calcein AM）和死细胞探针（ethidium homodimer-1）
鬼笔环肽-FITC试剂Sigma-AldrichP5282
罗丹明鬼笔环肽试剂InvitrogenR415
DAPI试剂Sigma-AldrichD9542
甲基丙烯酰氧乙基硫代氨基甲酰基罗丹明B（MeRho）试剂Polysciences, Inc.23591
牛血清白蛋白试剂Sigma-AldrichA7030
Tween 20试剂Sigma-AldrichP1379
Triton X-100试剂Sigma-AldrichT8787
Citrisolv试剂Fisher Scientific22-143975
微切石蜡试剂Polysciences, Inc.24202
Trizol 试剂试剂Invitrogen15596-026
0.22 μm 孔径尼龙注射器滤器设备Fisher Scientific09-719C
1 mL 一次性注射器设备BD Biosciences309602将注射器在统一高度处截断以用于紫外照射
宽口移液器吸头设备Sigma-AldrichP6800
配备365 nm滤光片的Omnicure紫外点固化系统设备EXFOS1000
254 nm 杀菌紫外光源设备大多数生物安全柜内置

参考文献

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