监测果蝇幼虫 Drosophila melanogaster 的心脏功能以用于生理学研究

摘要

我们介绍了多种监测幼虫心脏功能的方法 果蝇 用于评估间隙连接功能、离子通道突变、起搏活性调节以及药理学研究的相关问题。

摘要

我们介绍多种记录幼虫心脏功能的方法Drosophila. 这些方法可用于测量自由活动和固定状态下的完整幼虫的心率。为了直接控制心脏周围的环境，另一种方法采用解剖后的幼虫并移除内脏器官，以便将心脏浸浴在所需化合物中。暴露的心脏还允许监测膜电位，从而深入了解心肌细胞产生的离子电流以及沿心脏管路的电传导情况。这些方法在未来的实验中各有优缺点，下文将对此进行讨论。幼虫心脏制备提供了除原有模型之外的另一种模型选择Drosophila骨骼神经肌肉接头以研究细胞内钙调节在细胞功能中的作用。通过进一步了解不同物种肌细胞动作电位形成过程中涉及的基础离子电流，人们有望掌握与哺乳动物多种疾病相关的特定基因所引起的离子功能障碍。

方案

引言

昆虫和脊椎动物心脏功能的细胞机制惊人地相似。Drosophila melanogaster 被用于研究导致其他动物（包括人类）疾病状态的基因突变（Bier 和 Bodmer，2004；Peron et al.，2009）。目前，多种疾病正在这一易于操作的遗传生物体中被诱导产生（Dowse et al.，1995；Johnson et al.，1998；Ganetzky，2000；Bier 和 Bodmer，2004；Ocorr et al.，2007a，b），希望未来能够测试基因治疗以恢复其正常功能。此外，Drosophila 也是研究细胞水平生理功能的良好模型。

许多以往的研究关于 果蝇 心脏的研究主要集中在胚胎发育方面（Azpiazu 和 Frasch 1993，Bodmer 1993，Bodmer 等. 1990)。少数研究涉及前蛹期、蛹期或成虫期的生理功能（Ashton 等，2001；He 和 Adler，2001；Molina 和 Cripps，2001；Ponzielli 等，2002；Sláma 和 Farkaš，2005；Wessells 和 Bodmer，2004）。然而，蛹期伴随着变态过程、激素变化以及多种生物源性胺类物质的波动。此外，心脏本身也在经历结构上的转变，这在研究心肌细胞生理学时可能使变量控制变得困难（Dulcis 等. 2005；Johnson 等. 2002；Miller，1997；Papaefthimiou 和 Theophilidis，2001）。已知心脏在幼虫阶段具有自律性，可轻易摘除或保留 原位 在限定生理盐水中浸泡，以限制循环激素或肽类等混杂变量的影响（Dowse 等. 1995；Johnson 等. 1997；Dasari和Cooper，2006；Feng 等2004）。幼虫心脏的肌源性特性与哺乳动物心脏相似，均具有起搏细胞，可驱动心脏其余部分将液体以有效方式泵送至器官进行灌流。其变时性和变力性 果蝇 幼虫心脏具有研究价值，因其可作为快速检验哺乳动物心脏功能基本原理和病理效应的手段，同时有助于建立细胞生理学的比较模型，例如起搏细胞的离子调控。

幼虫心脏对生物源性胺类和肽类极为敏感，这些物质在血淋巴中的含量会因食物来源或动物自身的生理状态而变化（Dasari 和 Cooper，2006；Johnson et al. 1997, 2000；Nichols et al. 1999；Zornik et al. 1999）。研究内源性或外源性化合物如何从机制上影响心脏功能具有重要意义。如果我们能更深入地了解昆虫的生理学和药理学特性，就有可能开发出对其他生物影响更小的新型杀虫剂。

迄今为止，尚未描述神经递质和心脏调节因子在幼虫中的细胞作用机制，因为对参与并调控幼虫心脏起搏活动的离子电流和通道类型仍缺乏足够的了解。据我们所知，目前尚无报道记录黑腹果蝇（Drosophila）幼虫心肌细胞的细胞外或细胞内电生理信号以评估离子电流，从而阐明调节因子的作用机制。

在本报告中，我们介绍了多种记录幼虫心脏心率及生理特性的方法。

方法

完整的幼虫：

1. 一种观察完整跳动的幼虫心脏的有效方法是直接使用显微镜；然而，幼虫必须保持足够静止，才能准确计数心肌收缩次数。我们开发了用于监测自由活动幼虫以及固定幼虫心率的方法。根据具体的研究问题，其中一种方法可能比另一种更为适用。
2. 这些方法可用于长期追踪个体，但需注意避免脱水。这些方法还可用于评估通过饮食引入的药理学试剂，或用于检测突变品系发育过程中的不同阶段，以及热激基因诱导后的变化。
3. 我们称之为“蚁场”的第一种无约束方法。该技术由两片玻璃板组成，中间以一层幼虫食物隔开，形成狭窄间距。幼虫可在单一焦平面内被观察。该技术也曾用于监测幼虫的昼夜运动电活动（Cooper 和 Cooper，2004）。具体而言，该方法采用两片载玻片（75 × 25 mm；J. Melvin Freed 品牌），通过一层薄薄的幼虫食物（例如湿润的玉米粉——Lewis，1960 年方法的改良版）将其间隔开，间距为 1 至 1.5 mm，使幼虫可在同一焦平面内被清晰观察。常用于凝胶电泳板的间隔条（mini gel Bio-Rad；Life Science Research，Hercules，CA 94547，USA）效果极佳，因其具有不同厚度规格，可分别适用于一龄、二龄或三龄幼虫的蚁场实验。另一种选择是使用特定厚度的固体塑料片，将其挖空一定区域作为幼虫爬行空间。
4. 为防止幼虫从玻璃双层培养皿的边缘爬出，可使用适当厚度的塑料片进行封边。将平台轻微倾斜至20至45度，可使幼虫大部分时间保持头部朝下、尾部（含气门）位于食物表面之上或食物层中的空气通道内的状态。
5. 这 "蚂蚁农场技术" 还可在食物厚度均匀的单一层面上进行视频成像。在此配置下，幼虫倾向于不在食物中广泛爬行，而是在二维平面内进食并缓慢移动。通过显微镜载物台下方的镜子投射白光，以便根据需要调整光线位置，从而获得心脏或伴随心脏收缩而运动的两条气管的最佳对比度。使用一台显微镜（可调变倍范围0.67至4.5；World Precision Instrument；型号501379）。采用2X基础物镜和0.5X管镜，以获得足够的空间分辨率和放大倍数，覆盖1 cm × 0.5 cm的矩形区域。通过三目镜接口安装摄像头（Mintron, MTV；World Precision Instrument）。环境温度维持在20°C.
   
   
   图1. 完整标本的背侧视图3^rd 龄幼虫。通过观察心脏牵拉气管附着点引起的气管运动来测定心率。
6. 为监测自由活动的动物，可在动物头部滴加少量稀释的食物混合液。操作应在玻璃培养皿中进行，以便透射光穿过幼虫，从而观察心脏管。可使用上述相同的显微镜装置观察心跳并记录搏动次数。
7. 另一种方法是使用双面胶带将幼虫固定在载玻片的某一位置，使幼虫腹面接触胶带（Baker 等，1999）。然而，如果在喂养幼虫时胶带受潮，该方法效果不佳。为防止胶带受潮，可在幼虫基部及胶带边缘处涂抹凡士林（用细针注射）。此方法可实现长时间喂养幼虫，无需在幼虫移动于培养皿上时反复将其调整至焦平面。若需释放幼虫，可将胶带润湿，使其对动物的黏附性丧失。

如果不需要将幼虫释放用于实验，可以采用永久性固定方法，即将幼虫用胶水粘附在玻璃载片上以限制其活动。使用速干胶法时，幼虫仍可进食，并可在保持粘附于玻璃盖片的同时，被覆盖于湿润溶液中。操作步骤如下：

1. 取一张干净的载玻片，并在其一端放置一张盖玻片。
2. 在盖玻片的一个角落处滴一小点超级胶水。
3. 找到你的 Drosophila 幼虫，并将其从试管中取出。
4. 将幼虫放入培养皿中，用少量水冲洗，以去除多余的培养基。
5. 用小块纸巾或滤纸的角落吸去残留的食物。
6. 用镊子轻轻夹起幼虫，将其放置在载玻片上与盖玻片相对的另一端。
7. 将载玻片置于显微镜下，调节镜头对准幼虫。幼虫应腹面朝下、背面朝上。可通过以下特征区分幼虫的两侧：其背部具有两条呈“赛车条纹”状的气管，而腹面则有微弱的横向沟纹及极细的黑色刚毛。
8. 若幼虫方向不正确，可用镊子轻轻将其翻转至正确朝向。
9. 使用一套专用于胶水操作的新镊子，从盖玻片末端的胶滴中蘸取少量胶水，并将其点在另一端的角落处。胶水量应极微，仅需覆盖镊子尖端即可。同时，务必擦拭干净镊子末端，以防其被胶水粘合。
10. 在显微镜下再次检查，确保幼虫仍处于正确位置。若其已翻转，请参考步骤八进行调整。
11. 现在，使用处理幼虫的镊子轻轻夹起幼虫，将其平稳地放置在新涂抹的胶水上。确保黑色的口钩靠近或位于盖玻片边缘，且口钩或褐色的气门均不与胶水接触。
12. 小心地向下轻压幼虫，使其展平。
13. 当幼虫固定到位后，即可施加需要测试的物质。
14. 建议使用注射器吸取待测物质，并将其少量滴加至幼虫头部附近，供其摄取。
15. 最后，可通过在一分钟内计数气门搏动次数来观察心率。

原位：解剖并计数心率：

将制备好的标本沿腹侧中线纵向切开并展平固定。制备皿由一块玻璃载片（VWR）构成，其一侧粘附有磁性胶带（Best Buys零售店）。磁性条带中央有一个孔，便于使用透射光观察标本。解剖针（Fine Scientific Tools，WA）被弯折后粘在回形针上。回形针可在磁性胶带上灵活移动，用于固定剖开的标本。此类记录皿此前已有描述，可用于固定从蚂蟥腹神经索中分离出的神经节（Muller et al., 1981）。

1. 将完整的三龄幼虫放置在解剖板上。将幼虫翻转至腹面朝上，直至通过体壁不再可见气管。
2. 在完整的幼虫上插入四枚解剖针。两枚针置于口钩两侧，另外两枚针置于气门两侧。
3. 加入生理盐水，从头部的针附近开始做一横向切口，距离稍远，然后沿纵轴方向继续做横向切口，贯穿整个身体长度。
4. 在接近真心脏前一小段距离处停止切割。围绕真心脏及沿气门侧缘进行切割。
5. 抬起一侧背侧的解剖针，将其钩住体壁下方。利用该针打开体腔并撑开。对剩余的解剖针重复此操作。
6. 移除内脏组织时需小心，避免损伤气管或心脏。需注意某些结构与心脏相连，若强行移除可能造成损伤，包括多个脂肪体和脑。若在移除内脏过程中观察到心脏被拉伸，应立即停止对该结构的移除操作。

心脏现已暴露，可进行实验条件处理。

图2. 3号标本的腹侧解剖^rd 龄期以直接观察心脏。解剖后将动物背侧固定，可在中枢神经系统完整或不完整的情况下直接向心脏施加化合物。小箭头指示心脏与主动脉分离的位置，用于横断背血管研究（见下文）。Tr，气管；Sp，气门；H，心脏；AO，主动脉。

该解剖技术已被用于直接评估药物对黑腹果蝇（Drosophila）幼虫心脏的作用（Gu 和 Singh，1995）。解剖过程耗时 3–6 分钟。解剖完成后，将标本置于 HL3 生理盐水中孵育 3–5 分钟，使其充分松弛。

HL3 生理盐水的 pH 值被严格控制在 7.2，因为高 pH 会减慢心率，而低 pH 会加快心率（Badre et al., 2005）。Gu 和 Singh（1995）在心脏药理学分析中使用了 pH 7.0 的生理盐水，并同样证明了心脏活性的维持。在实验过程中，通过反复使用 21 号针头将生理盐水注入烧杯中以搅动溶液，从而保持盐水的充氧状态。

可通过直接观察或使用VHS录像带或数码相机记录图像，随后在屏幕上回放以定量测量心率。此前已有文献描述过光电二极管法（Dasari和Cooper，2006）。

热激处理：

1. 解剖幼虫。
2. 将解剖好的样本置于盖玻片上。
3. 加热水浴槽。
4. 通过将温度探针漂浮在盖玻片上，检查水浴槽内的温度。
5. 当温度达到理想值后，将样本连同盖玻片放入水浴槽中。
6. 使样本在水浴中保持所需时间，完成后取出。

可根据实验需求使用相应的热脉冲和温度。

电刺激心脏以起搏：

1. 使用注射器插入并密封尖端开口，将室温（21°C）的果蝇生理盐水（HL3）吸入聚焦电极（直径约20微米）中。将电极安装到操纵器上，并确认导线已浸入电极内的生理盐水中，同时确保刺激器处于关闭状态。
2. 将一只三龄幼虫期的黑腹果蝇（Drosophila）幼虫心脏解剖样本置于解剖显微镜下并固定。将接地导线放入样本的生理盐水中，注意避免与固定针和样本容器壁接触。
3. 使用操纵器将电极尖端定位至心脏顶部，根据需要调节显微镜焦距。实现该操作的最佳方法是在将电极尖端向下移动的同时，以电极为焦点进行调焦。
4. 当观察判断电极尖端已到位后，开启刺激器（型号 S9，Grass Instruments，美国马萨诸塞州昆西），设置频率为2 Hz，脉冲持续时间为0.5至1 ms，电压置于最低档位，延迟时间设定在12至14之间。
5. 在观察心脏节律的同时，将刺激频率调至约3 Hz，并缓慢增加电压，直至观察到的心脏节律与刺激器产生的节律同步。通常情况下，离体果蝇心脏的自发搏动频率约为2 Hz，因此当刺激频率高于其固有频率时，心脏将表现为比正常更快的搏动。电压不应超过约20 V，因高电压可能导致细胞损伤，从而使样本失效。一般情况下，根据电极与心脏之间的距离及接触密封情况，可在2至8 V范围内有效刺激心脏。
6. 若已达到最大电压但仍无反应，可尝试反转电极极性。若仍无效，则应移动探针，以在心脏上建立更好的接触连接。
7. 一旦建立起由刺激驱动的稳定节律，即可通过调节频率和脉冲持续时间来操控该节律。需注意的是，频率超过4 Hz时可能导致心脏进入强直收缩状态。在达到目标节律后，可加入不同种类的醇类或药理学试剂，观察其对缝隙连接的影响。当缝隙连接被阻断时，电信号无法传导，传播的节律将停止。
   
   
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测量场电位：

1. 玻璃电极由Kimax玻璃制成（外径：1.5 mm）。将玻璃管拉制并火焰抛光，制成内径在10至20 μm之间的记录尖端。
2. 电极腔内充满灌流液。放大器及连接至计算机的记录系统与后续细胞内记录所用系统相同。
3. 将“大斑片”记录电极（Stühmer et al., 1983）的腔端直接置于心脏的某一区域。心肌纤维的自发起搏活动会产生场电位，可通过该聚焦电极进行监测。
4. 需小心操作，轻柔地将电极腔端逐个区域下放并提起，以实现对心脏各区域的监测。电位信号通过大斑片电极记录。

可直接计数心率并监测电活动。在记录这些电位的同时改变灌流液成分，也可用于评估对场电位的影响。

测量细胞内电位：

为了监测心肌细胞的跨膜电位，需用充满3 M KCl的尖锐细胞内电极（电阻为20至30 mOhm）刺入心脏的某一区域。可使用标准的细胞内记录前置放大器和放大器；但我们采用了Molecular Devices公司（美国加利福尼亚州森尼韦尔）生产的Axonclamp 2B型放大器和1 X LU前置放大器。研究表明，心脏的尾端较为坚固，且起搏细胞主要位于此区域，因为大多数情况下心脏收缩由此区域启动（Badre et al., 2005；Dasari和Cooper，2006；Dasari et al., 2007）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
解剖工具：精细 #5 镊子和精细剪刀（均购自 Fine Science Tools (USA), Inc.，地址：373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139） 解剖显微镜，配备变焦功能，用于解剖操作及心率计数。心脏局灶刺激时也需使用该设备。 细胞外和细胞内记录使用配备直立物镜（4× 和 20×）的复合显微镜。 标准细胞内放大器和 A/D 数据采集板，用于计算机在线记录。电信号通过 PowerLab/4s 接口（ADInstruments，澳大利亚）进行在线记录。我们使用 ADInstruments 公司提供的标准 Chart 或 Scope 软件。 化学试剂：所有生理盐水试剂均购自 Sigma 化学公司（St. Louis, MO）。 用于细胞内记录的玻璃毛细管（FHC，Brunswick, ME, 04011, USA，目录号 #30-31-0）；用于局灶大电极记录和刺激电极的 Kimax-51 玻璃管（Kimble Products，货号 34502，内径 0.8–1.1 mm，长度 100 mm）。细胞内电极的电阻应为 20 至 30 mOhm。大电极通过电极拉制仪拉制出细尖后，折断尖端制成；折断处应为直径约 20μM 的平整垂直断裂面。随后将尖端加热抛光，使其内径约为 10μM，用于局灶细胞外记录。用于驱动心脏的刺激电极，其最终尖端直径约为 20–50 μM。将电极杆部通过加热元件加热，使其逐渐弯曲约 45 度。这样当电极与显微操作器成角时，相对于标本整体形成约 90 度的平面或垂直电极腔面。