用于自动化蛋白质组学处理的数字微流控技术

摘要

数字微流控技术是一种通过施加电场，在电极阵列上操控离散液滴（约纳升至毫升级）的方法。该技术非常适合进行快速、连续、微型化的自动化生化分析。本文报道了一种能够自动化完成多个蛋白质组学处理步骤的平台。

摘要

临床蛋白质组学已发展成为一个重要的新兴学科，有望发现可用于疾病早期诊断和预后的生物标志物。尽管临床蛋白质组学方法多种多样，但其共同特征是需要（i）从高度异质性的体液（如血清、全血等）中提取蛋白质，以及（ii）在分析前进行广泛的生化处理。本文报道了一种基于数字微流控（DMF）的新方法，整合了临床蛋白质组学中常用的多个处理步骤，包括蛋白质提取、再溶解、还原、烷基化和酶解消化。数字微流控是一种微尺度液体操控技术，可在开放表面上操控纳升至微升级别的液滴。液滴位于由介电层包覆的电极阵列上方；当对液滴施加电压时，介电层两侧会积累电荷。这些电荷作为静电“手柄”，可用于控制液滴的位置；通过依次偏置一系列电极，可实现液滴在表面上的分配、移动、合并、混合和分裂。因此，DMF 非常适合执行快速、连续、多步骤、微型化的自动化生化分析。该技术相较于依赖手动移液或机器人系统的传统方法具有显著进步，有望成为临床蛋白质组学中一种有用的新工具。

Mais J. Jebrail、Vivienne N. Luk 和 Steve C. C. Shih 对本研究的贡献相同。

Sergio L. S. Freire 的现地址为宾夕法尼亚州费城南 43 街 600 号费城科学大学，邮编 19104。

方案

第一部分：器件制备

1. 将玻璃基底浸入piranha溶液（浓硫酸:30%过氧化氢 = 3:1）中清洗，持续10分钟，并频繁振荡。
2. 用去离子水（DI水）冲洗基底后，用N₂气体吹干，随后将基底放入电子束蒸发腔中进行铬层沉积（厚度为250 nm）。
3. 为使镀铬基底脱水，先用异丙醇冲洗，然后在热板上115°C条件下烘烤5分钟。
4. 将基底干燥后，通过旋涂法（30秒，3000 rpm）涂覆六甲基二硅氮烷（HMDS）进行表面处理；再以相同参数旋涂Shipley S1811光刻胶。
5. 在热板上预烘基底（100°C，2分钟），然后通过掩膜对光刻胶进行紫外光（UV）照射曝光，曝光时间为5秒。
6. 将曝光后的基底浸入Shipley MF 321显影液中显影3分钟，随后用去离子水清洗，并在热板上后烘（100°C，1分钟）。
7. 将暴露的铬层浸入铬刻蚀液中刻蚀30秒；用去离子水冲洗后，再浸入AZ300T剥离液中10分钟，以去除残留的光刻胶；再次用去离子水冲洗，并用N₂气体吹干。
8. 通过化学气相沉积法在具有图案化铬层的基底上沉积2–5 μm厚的聚对二甲苯-C（Parylene-C，一种绝缘聚合物）；再将Teflon-AF溶液（1% wt/wt溶于Fluorinert FC-40）以2000 rpm旋涂60秒，在基底表面沉积50 nm Teflon-AF以增强疏水性；随后在热板上后烘（16....

讨论

蛋白质组学领域面临的一个主要局限是缺乏标准化的样品处理和加工流程。此外，传统的宏观尺度样品操作涉及多个容器和溶液转移步骤，可能导致样品损失和污染。解决这些问题的一个潜在方案是采用基于数字微流控技术¹（DMF）的集成化样品处理系统。在先前的研究中，已证明DMF可用于高效去除含有蛋白质的异质溶液中的不需要的污染物²。同样，DMF也被证实能够与多步液相处理过程（包括还原、烷基化和酶解）集成于单一设备中³。本文中，我们展示了一种完全集成的系统，该系统通过自动化液滴控制实现沉淀法蛋白质提取，随后进行液相处理。我们推测，如果此类方法被广泛采用，蛋白质组样品处理中固有的人为主观误差将可被大幅消除，从而获得更高重复性的分析结果。简而言之，我们认为DMF具有广泛适用于多种应用的潜力，因为其操作条件可在全球任何实验室中被精确复制。

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