数字微流体进行自动蛋白质组学处理

Summary

数字微流体操纵离散液滴（NL - ML）的特点是技术，电气领域的应用电极阵列。它是非常适合进行快速，连续化，小型化自动生化分析。在这里，我们报告的一个平台，能够自动化几个蛋白质组学的处理步骤。

Abstract

临床蛋白质组学研究已成为一个重要的新的学科，有前途的生物标志物，将有助于疾病的早期诊断和预后的发现。临床蛋白质组学方法虽然千差万别，一个共同的特点是:（一）需要极其庞杂的液体（如血清，全血等）和（二）广泛的生化处理，分析前中提取蛋白质。在这里，我们报告一个新的数字微流体（DMF）为基础的方法相结合用于临床蛋白质组学的几个处理步骤。这包括蛋白的提取，resolubilization，还原，烷基化和酶消化。数字微流体是一个微型的流体处理技术，在一个开放的表面上操纵纳升，微升大小的水滴。液滴涂绝缘层的电极阵列上的定位 - 当一个电势应用到液滴，收费积累的介质两侧。收费作为静电处理，可以用来控制液滴的位置，并通过偏置系列电极序列，水滴可以被免除，移动，合并，组合，和表面上的分裂。因此，DMF是一种自然适合进行快速，连续，多步，小型化自动生化分析。这意味着超过常规方法（依靠手动移液器或机器人）的一个显着的进步，并有可能成为一个有用的临床蛋白质组学的新工具。

MAIS研究杰布拉伊尔，利德北鹿，和史蒂夫消委会施同样对这项工作。

塞尔吉奥LS弗莱雷的当前地址是在费城科学大学位于南43街600，费城，PA 19104。

Protocol

第1部分:设备制造

1. 食人鱼的解决方案中的清洁玻璃基板（3:1浓硫酸:30％双氧水）。让食人鱼频繁搅拌10分钟的解决方案的基板。
2. 在去离子（DI）水冲洗后干燥与N ₂气体的基板，铬沉积（厚度为250 nm）的电子束室里面放置的基板。
3. 脱水铬涂层基板，在异丙醇冲洗，然后在5分钟的热板烘烤在115 ° C。
4. 通过旋涂（30秒，3000转），干与六甲基二硅氮烷（HMDS）的基板和总理。自旋大衣希普利S1811光刻胶（使用相同的参数）。
5. 预烘基板上的热板（100℃，2分钟），然后模式由暴露在紫外线（UV）照射5通过光罩小号光致抗蚀剂。
6. 希普利MF 321 3分钟和DI水冲洗开发商开发的紫外线暴露基板。后烤热板在100 ° C，持续1分钟。
7. 蚀刻暴露铬铬蚀刻液浸泡30秒在去离子水冲洗，然后在10分钟AZ300T脱衣舞的浸泡，以去除剩余的光致抗蚀剂。在DI水冲洗和干燥与N ₂气体。
8. 存款2-5微米的聚对二甲苯C（绝缘聚合物）通过化学气相沉积到基板图案铬轴承。存款50纳米聚四氟乙烯的AF旋涂在2000转的解决方案（1％Fluorinert WT / WT在FC - 40）（使表面疏水）60秒后烤热板（160℃，10分钟）。
9. 要形成顶板，大衣联合国图案的铟锡氧化物（ITO）玻璃基板50纳米聚四氟乙烯的AF，如上。
10. 后烤热板（160℃，10分钟）都基板。

第2部分:设备设置及自动化

1. 在"两板"配置操作的数字微流体装置^，1液滴之间的底部基板（图案电极）和顶部基板（一个连续的，透明电极，通常形成从ITO）的位置。
2. 要设置设备，取出一个用手术刀轻轻地刮取底部基板的接触片的聚合物涂层。夫妻暴露的底部基板焊盘与40针连接器（图1a）。
3. 电源的计算机上运行的LabView（美国国家仪器公司，美国德克萨斯州奥斯汀​​），一个自制的控制箱（具有高电压继电器阵列是由一个国家仪器DaqPad信号控制），函数发生器，放大器。计算机/控制箱，方便用户超过₁₀₀ V RMS / 18 kHz的信号通过40针连接器的设备应用程序的控制。
4. 组装定位于边缘的底部基板双面胶带两件（总厚度为140微米）的设备，并完成与unpatterned ITO幻灯片（顶板）。
5. 要初始化的控制系统，运行LabVIEW校准程序（内部书面）校准的反馈控制。
6. 装入适当水库（见下面的第3条，）的样品和试剂，并附上顶下基板（聚四氟乙烯涂层的一面朝下）。将接地连接器顶端的基板。
7. 在LabVIEW中加载的驱动代码（内部书面）和执行程序启动液滴驱动。

第3部分:样品和试剂的制备

1. 准备工作缓冲区（WB）:100毫米TrisHCl（pH值7.8）和0.08％聚醚F127 W / V。
2. 解散蛋白（S）在世界银行和吸管样品水库1（R - 1的）设备上的分析，如图1b所示。
3. 准备到R - 2 DI水的沉淀，20％三氯乙酸（TCA）和吸管。
4. 准备洗涤缓冲液，70/30氯仿/乙腈（ACN）和吸管到R - 4。
5. 准备到R - 5 resolubilizing缓冲区，100毫米碳酸氢铵（pH值8.0）和0.08％W / V，聚醚F127和吸管。
6. 还原剂， 三 （2 -羧乙基）膦（TCEP），溶解在世界银行和吸管在10毫米到R - 6。
7. 烷化剂，碘乙酰胺（IAM），溶解在世界银行和吸管在12毫米到R - 7。
8. 世界银行在一个平等的总蛋白样品浓度（见3.1以上）和吸管TO1 / 5到R - 8的浓度溶解胰蛋白酶。

第4部分:数字微流体样品处理

1. 自动执行下面的过程是由内部编写的LabVIEW代码。从水库配发的水滴的体积是指由电极的尺寸（在这种情况下，配发的水滴〜600nL）。
2. 分配从R - 1的含蛋白质样品液滴和液滴的沉淀，从R - 2（图2，第1帧）。合并两个水滴，并允许合并的液滴孵育5分钟，导致PR降水在表面上oteins（图2，帧2-3）。驱动上清液从沉淀的蛋白质废物水库，为R - ​​3（图2，第4帧）。
3. 免除从R - 4三种洗涤缓冲液的液滴，并推动整个沉淀蛋白质的浪费水库，为R - ​​3（图2，第5帧）。
4. 允许沉淀，干燥，免除从R - 5 resolubilizing缓冲液滴的蛋白质。允许缓冲区孵育20分钟，直到沉淀溶解（图2，帧6）。
5. 免除从R - 6液滴的还原剂和合并与样品液滴。混合驱动在一个圆形图案，它横跨6个电极相结合的液滴。允许液滴在湿盒（图3，帧1-2）为在室温下1小时孵育。
6. 分送一个液滴的R - 7烷基化剂和混合（4.5），与样品液滴合并。允许液滴孵育15 min，室温避光，在湿盒（图3，帧2-3）。
7. 液滴的胰蛋白酶，免除从R - 8和混合（4.5），与样品液滴合并。允许液滴孵育3小时37 °中的一个热点板块的湿盒（图3，帧3-4）彗星。

第5部分:处理后的样品制备

1. 卸下顶部基板和淬火消化反应，2.5％三氟乙酸在水中加入0.6毫升。
2. 净化淬火后的反应产物，根据制造商的指示使用（Millipore公司，比尔里卡，马萨诸塞州）C18 ZipTips。
3. DI水稀释纯化样品终体积为100 mL。

第6部分:质谱

1. 评估交配串联质谱仪在纳米高效液相色谱法处理样品。高效液相色谱系统用在这里是从Eksigent技术和装备是一个陷阱列（3毫米直径的。C18的珠子，150微米ID x 2.5厘米）和一个反相分离柱（直径3微米。C18的珠子，75微米内径x 15厘米）。这里使用的是热尔科技的LTQ质谱仪。
2. 在移动，包括5％乙腈水阶段，加载到5μL/min陷阱列2μL样品。在0.5μL/min反相列使用线性渐变，从20％乙腈超过25分钟至80％的乙腈样品分开。再过10分钟，继续运行在80％乙腈。
3. 洗脱列串联质谱分析频段。在这里的工作报告，洗脱液进入质谱仪通过nanoelectrospray发射器（20微米收窄至10微米的ID编号）从NewObjective采样。
4. 使用SEQUEST等数据库检索程序，确定样品中的蛋白质。在这项工作中，我们使用的版本SEQUEST Bioworks V3.01（热尔科技）成立，并确定蛋白质的概率分数小于1.0E - 03（相当于99.9％的置信区间），并在序列覆盖至少30％（图4）。

图1（a）一个图片一个二甲基甲酰胺装置配备40针连接器自动化液滴驱动。 （二）设备原理图描绘了一个蛋白质组学workup所需样品和试剂的定位。

从电影图2。帧描绘在20％TCA（沉淀）和70/30％氯仿/乙腈（冲洗液）自动提取和纯化的BSA。在第6帧，沉淀蛋白质溶解在100毫米碳酸氢铵液滴。

图3说明顺序还原，烷基化，消化resolubilized蛋白液滴从一个电影帧。在这个数字中，所用试剂为清晰起见，染料着色，在实践中，所用试剂均为不着色。

图4。MS色谱数字微流体处理的牛血清白蛋白的样品。 25个不同的肽（99.9％的置信区间），相应序列覆盖了44％。

Discussion

缺乏规范的样品处理和加工蛋白质组学是该领域的主要的限制。此外，传统的宏观样品处理涉及多个容器和解决方案转移，从而导致样品的损失和污染。这些问题的潜在解决方案是要形成综合系统为依托数字微流体¹甲酰胺（DMF）的样品处理。 ²同样，二甲基甲酰胺被证明是一个集成与整合多级的解决方案相处理（还原，烷基化和消化）兼容在以往的工作，DMF被证明是有效去除不必要的污染物在异构蛋白含解决方案的有用。设备^。3这里，我们已经演示了用溶液相加工的自动化蛋白提取液滴由降水控制完全集成的系统。我们推测，如果如这些方法被广泛采用，蛋白质组学样品处理固有的人为错误，可基本上消除了，在分析产生更好的可重复性。总之，我们建议，DMF具有了广泛的应用截面是有益的潜力，作为条件，可恰恰在世界上任何一个实验室复制。