采用利用自然表面张力保留样品而无需使用比色皿或毛细管的分光光度计系统，可对微量样品进行定量。该方法显著提高了蛋白质浓度的检测动态范围及检测速度。
本文内容
摘要
摘要
传统的分光光度法需要将样品放入比色皿或毛细管中。由于蛋白质分析通常使用的样品体积有限，这种方法往往不切实际。Thermo Scientific NanoDrop 2000c 分光光度计采用一种创新的样品保留系统，利用液体的表面张力特性将微体积样品固定在两个测量表面之间，从而实现低至 0.5–2 μL 体积样品的定量。无需使用比色皿或毛细管，可实时调整光程长度，不仅缩短了测量时间，还显著扩大了可测蛋白质浓度的动态范围。该方法也避免了稀释步骤，且样品定量前的准备工作相对简便，仅需用实验室擦拭纸清洁测量表面即可。本文视频展示了对传统蛋白质浓度测定方法的改进，用于通过 A280 吸光度读数或 BCA 比色法对微体积蛋白质样品进行定量分析。
方案
一、NanoDrop 2000c 分光光度计
NanoDrop 技术基于一种创新的样品保留系统，利用表面张力将微量样品固定在两个光学基座之间，无需使用比色皿或毛细管即可进行测量。NanoDrop 2000c 分光光度计采用该技术，可快速、简便地测量 0.5–2 μL 的蛋白质、DNA、RNA 及其他生物分子液滴。随着分子技术不断发展，分析所需的样品量日益减少，这一能力变得愈发重要。该微量分光光度计特别适用于样品有限的情况。然而，由于其操作简便、测量周期短且浓度检测范围广泛，即使在样品充足的条件下也同样适用。测量周期显著缩短，有助于科研人员提高整体工作流程的效率。
将微量样品直接置于检测表面之上，并通过表面张力在光纤末端之间形成液柱。该液柱构成垂直的光路。光源由氙闪光灯提供，通过使用线性CCD阵列的光谱仪分析透过样品的光。
从系统中移除比色皿等传统容器具有多个优势：测量所需样品量极少，清洁时只需用实验室擦拭纸擦拭光学表面即可，且可在测量过程中实时改变光程长度。
NanoDrop 2000c 可自动确定最佳光程（1 mm 至 0.05 mm），在无需稀释的情况下提供最广泛的蛋白质浓度测定范围。通过缩短光程，可测量更高浓度的蛋白质，从而有效避免大多数蛋白质样品需要进行稀释的步骤。例如，NanoDrop 2000c 可测定高达 400 mg/mL 的 BSA 浓度。
NanoDrop 2000c 分光光度计是一种全光谱分光光度计，用于测定 DNA、RNA、蛋白质及其他生物分子的吸光度。本视频方案将重点介绍蛋白质的测定。
II. 使用 A280 吸光度测量法测定微量蛋白质浓度
a. A280 测量原理
蛋白质A280法适用于含有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸残基或半胱氨酸-半胱氨酸二硫键并在280 nm处具有吸收峰的纯化蛋白质。该方法利用A280处的吸光度值，结合质量消光系数或摩尔消光系数，计算纯化蛋白质的浓度。直接A280测定的优点在于无需制作标准曲线即可确定蛋白质浓度。如果样品为未表征的蛋白质溶液、细胞裂解液或粗制蛋白质提取物，则建议使用NanoDrop 2000/2000c上预设的一种比色法，例如BCA法、Pierce 660 nm法、Bradford法或Lowry法。
b. 微量蛋白质 A280 测定 - 启动
- 从主菜单中选择 Protein A280 应用程序。
- 从下拉列表中选择待测样品的类型。对于大多数未知蛋白质混合物，推荐使用默认设置，即 1 Abs = 1 mg/mL。若测定的是已知的纯化蛋白质，可输入其质量消光系数，或摩尔消光系数及分子量，以更精确地确定蛋白质浓度。
- 从下拉列表中选择浓度单位。
c. 微量蛋白质 A280 测定 - 空白校正
- 使用适当的缓冲液建立空白对照。必须使用蛋白质所悬浮的缓冲液，其pH值应与样品溶液相同，离子强度应相似。注意：RIPA缓冲液在280 nm处会产生过高的吸光度，因此不适用于直接A280蛋白浓度测定。对于悬浮在RIPA缓冲液中的蛋白质，建议采用与RIPA缓冲液兼容的比色法测定蛋白浓度。
- 将2 μL适当的空白溶液加到底部基座上，放下臂杆，点击“空白”（Blank）。
- 使用干燥的实验室擦拭纸将上下基座上的空白溶液擦拭干净。
d. 微体积蛋白质 A280 测定 测定
重要注意事项：由于测量体积非常小，样品的均一性极为重要。为确保样品均一，应在取样检测前轻轻而充分地混匀样品。混匀和移液时应避免产生气泡。
由于不同蛋白质之间的表面张力存在差异，我们建议上样量为 2 μL，以确保形成适当的液柱。请始终使用低吸附枪头。上样时，将枪头接触下部光学基座表面，同时排出溶液，以防止溶液附着在枪头外壁。排出的样品量应少于全部体积，以避免吹出液体并在样品中引入气泡。
- 在相应字段中输入样本编号，按照空白样本的操作方法加载第一个样本的 2 μL，并点击“测量”。每次测量应使用新鲜的 2 μL 样本 aliquot。
- 使用干燥的实验室擦拭纸从下部和上部基座上移除样本。
e. 微量蛋白质 A280 测定 清洁
通常，使用普通的无绒实验室擦拭纸即可在测量间隙清洁光学基座。
f. 蛋白质 A280 测定的制备与重新平衡
含有表面活性剂的溶液和试剂可能会随着时间推移使测量基座表面失去原有性能，导致样品液柱无法形成。下部基座上液滴变扁平是光学表面已失活的迹象。如果表面特性已被破坏，则重新处理基座对于确保样品液柱的形成至关重要。一旦发生此情况，应使用实验室擦拭纸用力擦拭光学表面，或按照说明使用 NanoDrop 基座重新处理化合物（PR-1）进行处理。
III. 使用比色法测定微量蛋白质浓度
a. 比色检测原理
NanoDrop 2000c 分光光度计还可用于通过比色法测定未表征的蛋白质溶液、细胞裂解液和粗制蛋白质提取物。
比色法是一种间接方法，通过染料与样品中的蛋白质组分相互作用，生成一种在可见光波长范围内具有光吸收的新复合物。
NanoDrop 2000c 分光光度计预设了多种比色分析方法，包括 BCA、Pierce 660、Bradford 和 Lowry 法。本示例将以 BCA 法为例，演示如何使用微量分光光度计进行比色分析。（截图）
BCA（二辛可宁酸）法是一种常见的比色法，常用于测定稀释的蛋白质溶液以及含有在紫外光区（280 nm）具有显著吸收组分的蛋白质。与蛋白质A280法不同，蛋白质BCA法在测定样品蛋白质浓度之前，需要先绘制标准曲线。
该方法采用二辛可宁酸（BCA）作为检测试剂。在蛋白质存在下形成的Cu-BCA螯合物在562 nm处测定，并在750 nm处进行归一化。
b. 微量BCA法测定 蛋白质浓度 BCA法试剂制备
- 所需试剂包含于还原剂兼容型试剂盒中（Thermo Scientific Pierce 货号：23250）：BCA 试剂 A、BCA 试剂 B、兼容性试剂、复溶缓冲液以及牛血清白蛋白（BSA）标准品。
- 将所有待测蛋白样品及蛋白标准品平衡至室温，并充分混匀。
- 按试剂 A 与试剂 B 50:1 的比例配制足够量的新鲜工作液，用于标准品和样品的测定。
- 进行微量测定（micro assay）时，采用 1:1 的工作液与样品比例。在每支试管中加入 10 μL 工作液，并准备足够数量的试管以涵盖所有样品和标准品。进行高浓度范围测定（high-range assay）时，采用 20:1 的工作液与样品比例。在每支试管中加入 190 μL 工作液，并准备足够数量的试管以涵盖所有样品和标准品。请参考 Pierce BCA 试剂盒说明书，确定适用于您样品的比例。
- 向每支含有试剂的试管中加入 10 μL 标准品或样品，轻轻涡旋充分混匀。
- 将试管于 37 °C 孵育 30 分钟。
- 让反应体系恢复至室温（约 10 分钟）。
c. 微量 BCA 法测定 蛋白质标准曲线的绘制
- 从主菜单中选择蛋白质BCA法。如果出现波长验证窗口，请确保臂杆已放下。
- 在右侧窗格的表格中输入每个标准品的浓度值。软件允许设置一个参考标准品和最多7个附加标准品。参考标准品和/或附加标准品应进行重复测量。
注意：生成标准曲线的最低要求是测量两个标准品，或测量零浓度参考标准品及至少一个其他标准品。建议根据需要增加标准品数量，以覆盖预期的检测浓度范围。 - 建立空白对照。比色法检测中的空白对照通常为去离子H2O。
- 用移液器将2 μL的dH2O滴加到底部样品台，放下臂杆，然后点击“空白”（Blank）。仅需进行一次空白测量，即可用于后续所有参考标准品和标准品的测量。
- 通过移液器将2 μL仅含工作试剂和缓冲液但不含蛋白质的等分试样滴加到下部样品台，建立参考标准。放下臂杆，然后点击“测量”（Measure）。
- 在“标准品”（Standards）选项卡下，选中所需的标准品，将其2 μL滴加到下部样品台。放下臂杆，点击“测量”（Measure）。对所有标准品重复此操作。务必在测量样品前完成所有标准品的测量。如需查看标准曲线，请点击“查看标准曲线”（View Standard Curve）。
d. 微量 BCA 法蛋白质测定 2 μL 蛋白质测定
- 完成所有标准品的测量后，点击“样品”按钮。输入样品编号。取 2 μL 样品加载到下部基座上，然后点击“测量”。每次测量应使用新鲜的 2 μL 样品等分试样。
- 使用干燥的实验室擦拭纸将下部和上部基座上的样品擦拭干净。
e. 微量BCA法蛋白质浓度测定 清洗与再平衡
按照直接A280吸光度测量中所述的方法进行清洗和再生处理。
代表性结果：
微量蛋白质浓度测定可通过直接A280测量法或间接比色法进行。A280测量法根据目标蛋白质的消光系数来确定其浓度。BCA比色法通过已知蛋白质浓度的标准曲线来测定蛋白质浓度。
讨论
微量定量技术利用样品的固有表面张力特性，在两个测量表面之间形成液柱。由于无需使用容器，光程长度可实时变化，从而基本消除了稀释样品的需要。这一能力显著扩大了蛋白质浓度的动态检测范围，并提高了测量速度。通过使用极少量的样品，即可快速、准确地分析大量样本，使科研人员能够进行更多测量并实现更佳的质量控制。此外，在必要时，珍贵样品在测量后仍可回收利用。当测量如此微量的体积时，样品的均一性极为重要，以避免取样误差。加样时应始终使用低吸附枪头，并在不同样品重复之间更换枪头。测量台表面必须正确清洁和预处理，以确保获得最准确的结果。最后，当样品量有限时，微量分光光度计尤为理想；然而，由于其操作简便、测量速度快且动态范围宽广，即使样品充足时也同样适用。
披露
作者是赛默飞世尔科技公司的员工，该公司生产本文所使用的试剂和工具。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NanoDrop 2000c 分光光度计 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| 实验室擦拭纸 | |||
| Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23250 | 兼容还原剂 |
| PR-1 修复试剂盒 | Thermo Fisher Scientific, Inc. |
参考文献
- Aitken, A., Learmonth, M. Protein determination by UV absorption. , (1996).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).
- Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. , (2006).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. ujimoto, Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).
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