胚胎生殖细胞在早期发育阶段分化为原始生殖细胞的能力，是研究我们关于癌症与不育假说的理想模型。本方案展示了如何从小鼠交配后10.5至11.5天胚胎的发育性性腺中分离原始生殖细胞。
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摘要
摘要
胚胎生殖细胞（EG）在早期发育阶段分化为原始生殖细胞（PGCs），并进一步发育为配子的能力，是研究癌症与不育相关假说的理想模型。本实验方案介绍了如何从交配后10.5至11.5天（dpc）的小鼠胚胎发育性腺中分离原始生殖细胞。取C57BL/6J品系小鼠胚胎的发育性腺嵴，通过胶原酶进行机械性解离，随后接种于经丝裂霉素C处理而有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层（MEF-CF1）上，培养基为敲除型培养基，并添加白血病抑制因子（LIF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和干细胞因子（SCF）。采用这些优化的方法进行PGC的鉴定、分离及培养条件的建立，可实现EG细胞长期培养超过40天。所获得的胚胎生殖细胞系表现出胚胎样表型，并表达常用的多能性状态标志物。在体外培养中分离和衍生生殖细胞，为研究其发育过程提供了工具，同时也可在氧化应激暴露后，用于监测基因和表观遗传水平上的累积损伤。
方案
第1部分：孕鼠剖腹手术
- 采用颈椎脱位法处死一只妊娠10.5–11.5天的C57BL6J雌性小鼠。
- 用抗菌皂清洁腹部，然后剃毛。
- 剃毛后，用生理盐水清洗腹部。
- 接着，用无菌纱布将腹部擦干。
- 用新的无菌手术巾覆盖小鼠。
- 使用镊子和解剖剪进行腹侧切口。
- 识别并从腹腔中完整取出子宫。子宫内可见小鼠胚胎。
- 将子宫转移至盛有D-PBS的培养皿中，并置于冰上保存。
- 使用无菌手术刀和镊子，去除每个胚胎的胎盘和胚外组织。
- 将胚胎转移至另一盛有D-PBS的新鲜培养皿中。
- 测量小鼠胚胎的长度。我们发现胚胎大小随发育天数而异。例如，8.5 dpc胚胎平均长度为6 mm，10.5 dpc为11 mm，12.5 dpc为16 mm。
- 随后，剪取胚胎尾部用于DNA提取。
第二部分：性腺嵴解剖
在体视显微镜和 Schott Fostec 光源下
- 在培养皿中放入一张滤纸，然后将小鼠胚胎置于滤纸上，以干燥胚胎并固定，便于解剖。
- 使用无菌手术刀，在小鼠胚胎脐带起始位置上方进行横向切割。
- 在体视显微镜下，使....
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披露
本研究在密西西比州立大学对小鼠实验方案 #08030（活性氧（ROS）在生殖系发育和肿瘤形成中的作用：饲养与繁育方案）进行审查并获得机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准后开展。
致谢
作者谨此感谢以下人员提供的宝贵帮助： Neal First 博士和 Kourtney Wilkinson 在稿件编辑方面的协助；Lucy Senter 博士、Brigit Willeford 博士以及 Mike Basett 在密西西比州立大学经 ALAC 认证的小鼠设施中提供的培训与动物护理支持；Dwayne Wise 博士在显微镜使用和图像采集方面的协助；Cesar Monroy、Hannah Swoope 和 Bobbie Huddleston 在密西西比州立大学视频制作过程中提供的帮助。本研究由密西西比州立大学机构研究办公室和生物科学系资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 与同品系雄性小鼠交配的10.5–11.5天孕龄C57BL6J雌性小鼠 | |||
| 小鼠成纤维细胞 MEF-CF1 ATCC | SCRC-1040 | ||
| 杜尔贝科’D-磷酸盐缓冲液（D-PBS） | Invitrogen | 14190/086 | |
| 胶原酶/中性蛋白酶溶液 | 罗氏集团 | 269638 | |
| 明胶 | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| 丝裂霉素C | Sigma-Aldrich | M4287 | |
| 胰蛋白酶 EDTA | Invitrogen | 25200-072 | |
| MEF 培养基：Dulbecco 改良必需氨基酸培养基（D-MEM）GLUTAMAX 高糖 | Invitrogen | 10566024 | |
| 10% 胎牛血清 | Invitrogen | 16000/044 | |
| 1% 抗生素-抗真菌剂 | Invitrogen | 15420/096 | |
| Knockout 培养基：80% Knockout DMEM | Invitrogen | 10829/018 | |
| 20% Knockout血清 Invitrogen 货号 1028/028，200 mM L-谷氨酰胺 Invitrogen | 25130/081 | 与 β-巯基–乙醇 Sigma 目录编号：M7522 | |
| 1X 非必需氨基酸溶液 | Invitrogen | 11140/050 | |
| 1% 抗生素-抗真菌剂 | Invitrogen | 15420/096 | 添加生长因子，即 2500 U 的白血病抑制因子（mLIF-ESGRO），Millipore 货号：ESG1106 |
| 40 ng/ml 重组小鼠干细胞因子（SCF）ReproTech | 250-03 | ||
| 20 ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） | Invitrogen | 13256-029 | |
| 康宁中心孔培养皿 60 mm | Fisher Scientific | 07-200-79 | 1.5 ml 离心管，和 15 ml 离心管 |
| 14号和15号镊子、35 mm手术刀、解剖剪、手术巾、抗菌皂、0.9%生理盐水、纱布、冰泡沫容器、刀片、35 mm手术刀、4号和5号精细镊子、带手柄精细解剖针、滤纸片、拉制玻璃移液管 设备：解剖体视显微镜、Schott Fostec 光源、倒置显微镜、10 和 200 μl 微量移液器、离心机、生物安全柜。 | |||
<在交配后10.5至11.5天的小鼠胚胎中分离原始生殖细胞（PGCs）的方案提供了一个理想模型，用于研究癌症与不孕症相关的假设。本实验方法描述了如何从小鼠胚胎发育中的性腺中分离原始生殖细胞。取C57BL6J品系小鼠胚胎的发育性腺嵴，通过胶原酶进行机械解离，随后接种于经丝裂霉素C处理而有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层（MEF-CF1）上，培养基采用敲除血清培养基（knockout media），并补充白血病抑制因子（LIF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）以及干细胞因子（SCF）。通过优化原始生殖细胞的鉴定、分离及培养条件，可实现胚胎生殖细胞（EG）体外长期培养超过40天。所建立的胚胎生殖细胞系表现出胚胎样表型，并表达多种常用的多能性状态标志物。体外分离与培养生殖细胞为研究其发育过程提供了工具，同时也可在氧化应激暴露后，用于监测基因与表观遗传水平的累积性损伤。>设备：解剖立体显微镜、Schott Fostec 光源、倒置显微镜、10 和 200 μl 微量移液器、离心机、生物安全柜。 | |||
设备：解剖显微镜、Schott Fostec 光源、倒置显微镜、10 和 200 μl 微量移液器、离心机、生物安全柜。 | |||
| 设备：解剖体视显微镜、Schott Fostec 光源、倒置显微镜、10 和 200 μl 微量移液器、离心机、生物安全柜 |
参考文献
- DeFelici, M. Cell Biology: A laboratory Handbook. 1, Second Edition, 73-85 (1998).
- Donovan, P. J., De Miguel, M. P. Turning Germ Cells into Stem Cells. Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).
- Labosky, P. A., Hogan, B. L. M. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: ....
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