胚胎生殖细胞在早期发育阶段分化为原始生殖细胞的能力，是研究我们关于癌症与不育假说的理想模型。本方案展示了如何从小鼠交配后10.5至11.5天胚胎的发育性性腺中分离原始生殖细胞。
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摘要
摘要
胚胎生殖细胞（EG）在早期发育阶段分化为原始生殖细胞（PGCs），并进一步发育为配子的能力，是研究癌症与不育相关假说的理想模型。本实验方案介绍了如何从交配后10.5至11.5天（dpc）的小鼠胚胎发育性腺中分离原始生殖细胞。取C57BL/6J品系小鼠胚胎的发育性腺嵴，通过胶原酶进行机械性解离，随后接种于经丝裂霉素C处理而有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层（MEF-CF1）上，培养基为敲除型培养基，并添加白血病抑制因子（LIF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和干细胞因子（SCF）。采用这些优化的方法进行PGC的鉴定、分离及培养条件的建立，可实现EG细胞长期培养超过40天。所获得的胚胎生殖细胞系表现出胚胎样表型，并表达常用的多能性状态标志物。在体外培养中分离和衍生生殖细胞，为研究其发育过程提供了工具，同时也可在氧化应激暴露后，用于监测基因和表观遗传水平上的累积损伤。
方案
第1部分：孕鼠剖腹手术
- 采用颈椎脱位法处死一只妊娠10.5–11.5天的C57BL6J雌性小鼠。
- 用抗菌皂清洁腹部，然后剃毛。
- 剃毛后，用生理盐水清洗腹部。
- 接着，用无菌纱布将腹部擦干。
- 用新的无菌手术巾覆盖小鼠。
- 使用镊子和解剖剪进行腹侧切口。
- 识别并从腹腔中完整取出子宫。子宫内可见小鼠胚胎。
- 将子宫转移至盛有D-PBS的培养皿中，并置于冰上保存。
- 使用无菌手术刀和镊子，去除每个胚胎的胎盘和胚外组织。
- 将胚胎转移至另一盛有D-PBS的新鲜培养皿中。
- 测量小鼠胚胎的长度。我们发现胚胎大小随发育天数而异。例如，8.5 dpc胚胎平均长度为6 mm，10.5 dpc为11 mm，12.5 dpc为16 mm。
- 随后，剪取胚胎尾部用于DNA提取。
第二部分：性腺嵴解剖
在体视显微镜和 Schott Fostec 光源下
- 在培养皿中放入一张滤纸，然后将小鼠胚胎置于滤纸上，以干燥胚胎并固定，便于解剖。
- 使用无菌手术刀，在小鼠胚胎脐带起始位置上方进行横向切割。
- 在体视显微镜下，使用无菌精细镊子和无菌精细解剖针，去除肠道和肝脏，使泌尿系统暴露可见。
肾脏位于腹腔两侧，膀胱则相对于肾脏位于中线偏尾侧位置。若性腺嵴位于膀胱两侧，则可判定该胚胎为雄性；而在雌性中，性腺嵴牢固附着于肾脏尾侧外端。 - 用解剖针从性腺嵴后方轻轻滑入并剥离性腺嵴，通过切断其周围支持组织将其完整移除。
- 将分离的性腺嵴转移至另一盛有新鲜D-PBS的培养皿中。
在显微镜下观察，雄性性腺嵴应呈光滑、较大且为椭圆形；而雌性性腺嵴则表面有斑点、呈细长形，且体积较雄性性腺嵴小。
第3部分：性腺嵴消化
在体视显微镜下：
- 中肾解剖：使用精细且锋利的针将性腺从中肾及生殖嵴中分离。
- 必须从中肾嵴上完全去除中肾组织，因为中肾属于体细胞组织，在原始生殖细胞（PGC）分离过程中会过度生长。
- 生殖嵴消化：将洁净的生殖嵴收集至一滴0.5 µL的新鲜D-PBS液滴中，加入20 µL胶原酶/分散酶溶液（终浓度为1 mg/mL）。
- 胚胎应逐个处理，每个胚胎需使用独立且标记清楚的培养皿。
- 生殖嵴剪碎：使用无菌针头和4号无菌精细镊子将生殖嵴剪切成小块。
- 孵育：将培养皿转移至37°C培养箱中孵育15分钟。
- 不同组织的孵育时间可能有所差异。
- 吹打：孵育15分钟后，通过吹打使组织解离。使用拉制的玻璃毛细管移液器（直径40–100 µm），反复吹打以破碎组织块，形成小团块。将团块转移至0.5 mL预热的D-PBS液滴中进行最终洗涤。
- 洗涤后，将团块转移至离心管中。
- 避免组织过度暴露于胶原酶中。
- 切勿制备成单细胞悬液，这对克隆形成至关重要。若形成单细胞悬液，原始生殖细胞（PGCs）易发生分化和迁移。
- 整个操作过程不应超过20分钟，否则细胞活力将下降。
- 室温下以2000 rpm离心5分钟。
- 离心后弃去上清液，将沉淀重悬于0.5 mL添加补充物的敲除培养基中（预热至37°C）。
第4部分：原始生殖细胞培养
为了保持原始生殖细胞（PGCs）的活性以用于分离和获取，您应迅速进行接下来的步骤。
- 在此操作前24小时，应按照Zhang J. 等人2008年的方案制备有丝分裂失活的MEF-CF1饲养层。
- 每只怀孕雌鼠（6-8个胚胎）准备20个培养皿。
- MEF在传代5-6次后将失去作为饲养层的能力（即促进生长并防止分化）。
- 不要使用超过48小时的MEF。
- 在接种原始生殖细胞（PGC）前，必须缓慢移除MEF饲养层中的MEF培养基。
- 随后，在MEF饲养层上每孔加入0.5 ml预热的添加补剂的敲除培养基。
- MEF培养基中含有胎牛血清，可诱导PGC分化。
- 敲除培养基必须在使用前立即添加物种特异性的生长因子，以确保生长因子的活性。
- 采用对称分布的方式，将PGC接种至MEF饲养层上。
- 若组织块之间距离过近，容易发生聚集，形成致密的克隆，导致贴壁不良或开始分化。
- 培养皿必须标记胚胎生殖细胞系名称、传代次数和日期。
- 小心地将培养皿转移至37°C、5% CO2的培养箱中。
- 每隔24小时观察一次细胞状态。
- 48小时后，从培养液最上层小心移除250 ml培养基，避免扰动克隆的贴附；然后加入250 ml新鲜的添加补剂的敲除培养基（预热至37°C）。
- 完成第7步后，再等待48小时，随后完全移除所有培养基，并更换为新鲜的添加补剂的敲除培养基（预热至37°C）。此后每2天更换一次，持续8-10天，直至PGC克隆形成。
第5部分：胚胎生殖细胞
- 在原始生殖细胞分离后10天，形成胚胎生殖细胞集落。
- 胚胎生殖细胞系通过每8-10天进行一次人工传代来维持存活。这些细胞持续呈现未分化形态，并表达多能性标志物，如碱性磷酸酶、Oct-4、SSEA-1和SOX-2。
注意事项
- 培养室中必须保持无菌/无菌操作条件。
- 原始生殖细胞（PGCs）的分离与培养均在II级生物安全柜中进行。
- 孵育条件为37°C、5% CO2的湿化培养箱。
- 所有培养基和试剂在使用前均需经0.2 µm滤膜过滤，4°C保存，并在使用前于37°C预热。
- 解剖步骤中，所有胚胎和组织必须保持在冰上。
- 所有试剂瓶在放入生物安全柜前须用乙醇去污染处理。
- 必须佩戴手套、实验服和护士帽。
结论
我们提供了一段视频，演示如何从10.5至11.5天小鼠胚胎的生殖嵴中分离、获取并培养胚胎生殖细胞。可重复的胚胎生殖细胞系分离与长期培养，为研究早期胚胎发育、遗传与表观遗传的生殖模式、性腺形成、配子发生过程中周围器官的环境影响，以及导致癌症和不育的通路机制，提供了关键的基础。
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披露
本研究在密西西比州立大学对小鼠实验方案 #08030（活性氧（ROS）在生殖系发育和肿瘤形成中的作用：饲养与繁育方案）进行审查并获得机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准后开展。
致谢
作者谨此感谢以下人员提供的宝贵帮助： Neal First 博士和 Kourtney Wilkinson 在稿件编辑方面的协助；Lucy Senter 博士、Brigit Willeford 博士以及 Mike Basett 在密西西比州立大学经 ALAC 认证的小鼠设施中提供的培训与动物护理支持；Dwayne Wise 博士在显微镜使用和图像采集方面的协助；Cesar Monroy、Hannah Swoope 和 Bobbie Huddleston 在密西西比州立大学视频制作过程中提供的帮助。本研究由密西西比州立大学机构研究办公室和生物科学系资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 与同品系雄性小鼠交配的10.5–11.5天孕龄C57BL6J雌性小鼠 | |||
| 小鼠成纤维细胞 MEF-CF1 ATCC | SCRC-1040 | ||
| 杜尔贝科’D-磷酸盐缓冲液（D-PBS） | Invitrogen | 14190/086 | |
| 胶原酶/中性蛋白酶溶液 | 罗氏集团 | 269638 | |
| 明胶 | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| 丝裂霉素C | Sigma-Aldrich | M4287 | |
| 胰蛋白酶 EDTA | Invitrogen | 25200-072 | |
| MEF 培养基：Dulbecco 改良必需氨基酸培养基（D-MEM）GLUTAMAX 高糖 | Invitrogen | 10566024 | |
| 10% 胎牛血清 | Invitrogen | 16000/044 | |
| 1% 抗生素-抗真菌剂 | Invitrogen | 15420/096 | |
| Knockout 培养基：80% Knockout DMEM | Invitrogen | 10829/018 | |
| 20% Knockout血清 Invitrogen 货号 1028/028，200 mM L-谷氨酰胺 Invitrogen | 25130/081 | 与 β-巯基–乙醇 Sigma 目录编号：M7522 | |
| 1X 非必需氨基酸溶液 | Invitrogen | 11140/050 | |
| 1% 抗生素-抗真菌剂 | Invitrogen | 15420/096 | 添加生长因子，即 2500 U 的白血病抑制因子（mLIF-ESGRO），Millipore 货号：ESG1106 |
| 40 ng/ml 重组小鼠干细胞因子（SCF）ReproTech | 250-03 | ||
| 20 ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） | Invitrogen | 13256-029 | |
| 康宁中心孔培养皿 60 mm | Fisher Scientific | 07-200-79 | 1.5 ml 离心管，和 15 ml 离心管 |
| 14号和15号镊子、35 mm手术刀、解剖剪、手术巾、抗菌皂、0.9%生理盐水、纱布、冰泡沫容器、刀片、35 mm手术刀、4号和5号精细镊子、带手柄精细解剖针、滤纸片、拉制玻璃移液管 设备：解剖体视显微镜、Schott Fostec 光源、倒置显微镜、10 和 200 μl 微量移液器、离心机、生物安全柜。 | |||
<在交配后10.5至11.5天的小鼠胚胎中分离原始生殖细胞（PGCs）的方案提供了一个理想模型，用于研究癌症与不孕症相关的假设。本实验方法描述了如何从小鼠胚胎发育中的性腺中分离原始生殖细胞。取C57BL6J品系小鼠胚胎的发育性腺嵴，通过胶原酶进行机械解离，随后接种于经丝裂霉素C处理而有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层（MEF-CF1）上，培养基采用敲除血清培养基（knockout media），并补充白血病抑制因子（LIF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）以及干细胞因子（SCF）。通过优化原始生殖细胞的鉴定、分离及培养条件，可实现胚胎生殖细胞（EG）体外长期培养超过40天。所建立的胚胎生殖细胞系表现出胚胎样表型，并表达多种常用的多能性状态标志物。体外分离与培养生殖细胞为研究其发育过程提供了工具，同时也可在氧化应激暴露后，用于监测基因与表观遗传水平的累积性损伤。>设备：解剖立体显微镜、Schott Fostec 光源、倒置显微镜、10 和 200 μl 微量移液器、离心机、生物安全柜。 | |||
设备：解剖显微镜、Schott Fostec 光源、倒置显微镜、10 和 200 μl 微量移液器、离心机、生物安全柜。 | |||
| 设备：解剖体视显微镜、Schott Fostec 光源、倒置显微镜、10 和 200 μl 微量移液器、离心机、生物安全柜 |
参考文献
- DeFelici, M. Cell Biology: A laboratory Handbook. 1, Second Edition, 73-85 (1998).
- Donovan, P. J., De Miguel, M. P. Turning Germ Cells into Stem Cells. Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).
- Labosky, P. A., Hogan, B. L. M. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: isolation and in vitro culture. Molecular embryology: methods and protocols. Sharp, P. T., Mason, I. 97, Humana Press. Totowa, NJ. (1999).
- Mc Laren, A., Southee, D. Entry of Mouse Embryonic Germ Cells into Meiosis. Developmental Biology. 187, 107-113 (1997).
- Yoshimizu, T., Obinata, M., Matsui, Y. Stage-specific tissue and cell interactions play key roles in mouse germ cell specification. Development. 128, 481-490 (2001).
- Zhang, J., Hhvorostov, I., Teitell, M. From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs. J Vis Exp. , (2008).
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