利用酵母作为模式系统研究人类DNA修复蛋白的遗传学

摘要

利用酵母进行遗传学研究可用于探讨人类基因在细胞DNA代谢中的分子和细胞功能。本文描述了利用酵母这一易于操作的模式系统，在功能保守的通路中对早衰疾病——维尔纳综合征（Werner syndrome）中存在缺陷的人类WRN基因产物进行遗传学表征的方法。

摘要

理解人类DNA修复蛋白在遗传通路中的作用对许多研究人员而言是一项艰巨的挑战。由于缺乏现成的工具，包括明确的突变遗传细胞系、可调控的表达系统以及合适的可筛选标记，哺乳动物系统中的遗传学研究受到了限制。为了克服这些困难，低等真核生物中的模式遗传系统已成为研究功能保守的DNA修复蛋白及通路的优选方案。我们已建立了一种酵母模型系统，用于研究维尔纳综合征解旋酶-核酸酶（Werner syndrome helicase-nuclease,WRN) 在核酸代谢中的作用。可通过研究具有明确遗传突变背景的细胞表型，以阐明其在细胞和分子水平上的功能。WRN通过其催化活性和蛋白质相互作用。人类WRN基因及其相关变异体可克隆至DNA质粒中，用于在酵母中表达，并可由调控性质粒元件控制其表达。随后可将表达载体转化至相应的酵母突变体背景中，并通过多种方法检测其遗传功能。利用该方法，我们确定WRN，与其相关的RecQ家族成员BLM和Sgs1类似，作用于一条依赖Top3的通路，该通路可能在基因组稳定性中发挥重要作用。相关内容详见我们最近发表的出版物[1]www.impactaging.com本文提供了酵母中基因互补研究的特定检测方法的详细步骤。

方案

1. 酵母菌株

已鉴定的菌株包括具有野生型 SGS1 TOP3（WT；W303-1A，基因型为 MATa ade2-1 canl-100 his3-11,15 leu2-3,112 trpl-l ura3-1）[2]、sgs1 突变体（W1292-3C；基因型为 MATa SUP4-o::URA3 sgs1-25 ade2-1 can1-100 his3-11,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 rad5-535）以及 sgs1 top3 突变体（W1058-11C，基因型为 MATa SUP4-o::URA3 sgs1-25 top3-2::HIS3 ade2-1 can1-100 his3-11,15 leu2-3,112 trp1-1 ura3-1 rad5-535）[3]，这些菌株由美国哥伦比亚大学 Rodney Rothstein 博士惠赠。

2. 质粒DNA构建

WRN

讨论

利用酵母作为模式系统的优势之一，在于可以获得特定DNA复制和修复通路的突变体，这些通路在酵母与人类之间是保守的。由于实验室菌株为营养缺陷型突变体，且带有营养缺陷型标记的载体易于获取，因此对携带特定基因的转化子进行筛选既简便又可靠。利用这些载体，可通过将目标基因置于可诱导启动子（例如gal可诱导启动子等）的控制之下，实现对基因产物表达的调控。鉴于上述优势，我们建立了一个基于酵母的模型系统，用于研究在人类与酵母间可能保守的通路中，与Werner综合征相关的WRN基因的功能需求。通过所描述的方法，我们首次提供了WRN能够在影响top3-相关表型的遗传通路中发挥作用的证据。我们的观察结果提示，有必要进一步探究WRN在人类细胞的DNA复制或重组过程中是否与Top3α存在功能上的相互作用。可以设想，在BLM功能受损的情况下，WRN可能通过与拓扑异构酶的蛋白相互作用，部分地替代BLM的功能。

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