本文展示了如何对成年斑马鱼进行眶后静脉窦注射。
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摘要
摘要
对整体动物进行药物处理是药理学和化学生物学研究中任何模型系统的基本工具。静脉（IV）注射通常是递送目标试剂最有效且创伤最小的方式。在斑马鱼（Danio rerio)，由于血管直径较小，对斑马鱼进行静脉注射药物一直是一项挑战。这在造血干细胞移植过程中注射细胞时也构成了重大障碍。传统上，进入血液循环的注射是直接通过心脏进行的。然而，这种心脏内注射方法具有很高的死亡率，因为在注射过程中心脏常常被刺穿，导致斑马鱼容易发生感染、大量失血或致命的器官损伤。借鉴我们在小鼠实验中的经验，我们开发了一种新的斑马鱼注射方法，注射部位位于眼球后方并进入眶后静脉窦。这种眶后（RO）注射技术已成功应用于成年斑马鱼的药物注射以及全肾髓细胞的移植。与传统的心内注射相比，RO注射的死亡率显著降低。接受眶后注射的斑马鱼在注射后出血较少，且对心脏等重要器官造成损伤的风险大大降低。此外，若操作得当，注射的细胞和/或药物可迅速进入血液循环，使化合物能够对整条鱼发挥作用，同时使肾细胞易于归巢至其微环境。因此，这种新的注射技术在最大限度降低死亡率的同时，实现了将物质高效递送至成年斑马鱼血液中的目标。本文以Tg(globin:GFP) 细胞注入成年个体casper鱼类以及红色荧光染料（右旋糖酐，Texas Red）的注射 ) 转化为成体casper鱼。然后通过整体动物荧光显微镜观察来验证注射是否成功。
方案
第1部分. 注射材料的制备
- Tg(globin:GFP) 细胞：
- 使用涂有肝素（1 单位/微升）的 10 微升移液枪头刺破成年供体鱼的鳃后部，进行采血。
- 吸取红细胞并将其加入细胞缓冲液（0.9× PBS + 5% FBS + 1% 青霉素/链霉素）中。
- 将细胞悬液通过 40 µm 滤网过滤，并使用血细胞计数板按照 LeBlanc 等人先前描述的方法测定细胞浓度。
- 离心后重悬于细胞缓冲液中，调整至所需浓度，使最终注射体积不超过 5 µL。本实验中，每条受体鱼注射 150 万至 200 万个细胞。
- 对于德克萨斯红®葡聚糖，将染料溶解于 DPBS 中，使最终注射浓度为 10–12 mg/mL。计划每条鱼注射 4 µL。
第2部分. 注射
- 用三卡因（4.2 ml (4 mg/ml) 三卡因 / 100 ml 鱼用水）麻醉斑马鱼。
- 注射前用 70% 乙醇清洗 Hamilton 注射器 3–4 次，再用 0.9X DPBS 冲洗 3–4 次。
- 将鱼背侧朝上、头朝右放置在湿润的海绵上。
- 右手持 Hamilton 注射器，食指置于活塞上，左手轻轻固定鱼体。
- 将针头斜面朝上放置，假设鱼眼为时钟，针头应指向 7:00 位置，并与鱼体呈 45 度角（图 1）。
- 将针头轻柔地插入 7:00 位置 1–2 mm，然后缓慢下压活塞。
- 将鱼放入新鲜 E3 水中恢复。
- 在注射不同试剂之间，按上述方法清洗针头。
- 每隔几分钟轻弹细胞溶液以重悬细胞，防止细胞聚集。
- 处理后将鱼从循环水流中移出，持续 1 周，每日更换水以避免感染。此期间我们将鱼饲养在 ICU 水中（每 38 升 E3 水中加入 10 mL Stress Coat + 5 mL Pemafix + 5 mL Melafix）。
第3部分. 典型结果
如果操作正确，并且注射物质经过某种方式标记，则可以观察到注射物。例如，在注射后不久，应在荧光体视显微镜下观察到Tg(globin:GFP)红细胞在受体casper鱼的血管系统中循环，如图2所示。同样，将70 kDa Texas Red®标记的葡聚糖通过眶后注射到透明鱼体内后，可立即在血管系统中观察到荧光信号（图3）。来自Tg(β-actin:GFP)供体鱼的荧光肾脏细胞也可通过眶后途径注射到经辐照的casper受体鱼体内。这些细胞最终会归巢至受体的肾髓腔（图4a），并在数周后进一步重建肾脏造血组织（图4b）。
如果注射过浅或针头角度避开了眶后静脉窦腔，可观察到注射物质在眼部周围积聚或流出。相反，如果注射过深，鱼类可能会出现组织损伤或大量出血，尽管仍可能恢复。正确操作时，眶后注射后的死亡率应低于总注射鱼类的5%，而成功将物质递送至血液循环的比例应高于90%。
图1: 眶后注射技术示意图。鱼的右眼被表示为一个类比时钟，其中七点钟位置对应正确的注射位点。
图 2: 成年casper鱼经眼眶后注射三天后，尾部血管中循环的 Tg(globin:GFP) 红细胞。
图 3: 将作为染料使用的 Texas Red® 标记的 70 kDa 葡聚糖成功注射后，在透明成年斑马鱼 casper 中可观察到荧光标记的血管系统，使用标准的全动物荧光显微镜即可清晰观察。
图 4a：将来自 Tg(β-actin:GFP) 供体鱼的全肾髓细胞经眶后注射后三天，可在经辐照的成年 casper 受体鱼的肾髓中观察到这些细胞的归巢现象。
图4b：通过眶后注射来自Tg(β-actin:GFP)供体鱼的全肾髓细胞四周后，可在经辐照的成年casper受体鱼中观察到绿色供体全肾髓细胞对受体肾脏的重建造影。
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讨论
成年斑马鱼的眶后注射可实现注入物质进入血液的最高递送效率，同时死亡率最低。由于注射部位的特性，穿刺点似乎愈合迅速，从而减少了感染的发生以及失血量。例如，在短期内可对同一部位进行多次重复注射，以实现药物的每日给药。
在传统的成年鱼类治疗方法中，需要购买大量药物，仅通过将鱼类浸泡在含有目标药物的水中进行给药。然而，若将药物直接注射入动物的血液中，则所需药物剂量显著减少，从而降低实验成本。对于某些因分子过大而无法通过浸泡进入鱼类循环系统的化合物（例如某些肽类），经眶后注射可能更具优势。
此外，由于在成年鱼中，眶后注射比心脏内注射技术更快、更简便，因此眶后注射的另一应用可能包括成年鱼的化学遗传学筛选。因此，眶后注射可极大促进需要化学物质或药物递送的斑马鱼研究。
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致谢
本工作由霍华德·休斯医学研究所及美国国立卫生研究院（NIH）资助，用于研究胚胎造血作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 肝素钠盐（源自猪肠黏膜） | Sigma-Aldrich | 2106 | 300 USP 单位预称重小瓶 |
| Tricaine-S | 西方化学 | MS-222 | |
| 杜尔贝科’磷酸盐缓冲液 | Invitrogen | 14190-144 | |
| Texas Red 葡聚糖® | 分子探针，Life Technologies | D1830 | |
| E3 | 5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO₄2 | ||
| 微升注射器 | Hamilton公司 | 80300 | 701N 10μL 注射器（26s/2”/2) |
参考文献
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal. 37, 26-32 (2008).
- Pinkerton, W., Webber, M. A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route. Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).
- White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J. Vis. Exp. , (2007).
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