使用葡聚糖硫酸钠（DSS）建立小鼠结肠炎模型

摘要

在饮水中给予硫酸葡聚糖钠（DSS）是一种已建立的急性结肠炎小鼠炎症损伤模型。本方案概述了DSS处理的方法以及组织制备的步骤。

摘要

结肠炎可能由病毒或细菌感染、缺血性损伤或自身免疫性疾病引起，其中最典型的是溃疡性结肠炎以及克罗恩病的结肠型——克罗恩结肠炎。急性结肠炎可表现为腹痛和腹胀、吸收不良、腹泻、便血以及粪便中带有黏液。我们正逐步理解环境、遗传因素与上皮屏障功能障碍在炎症性肠病中的复杂相互作用，而结肠炎的动物模型在推动对该疾病认知方面发挥了关键作用。一种常用模型是将低分子量的葡聚糖硫酸钠（DSS）添加至小鼠的饮用水中，从而导致结肠上皮损伤，并引发持续数天的显著炎症反应。¹该方法的多种变体可用于模拟急性损伤、急性损伤后的修复过程，以及反复交替的DSS处理与恢复期，从而建立慢性炎症性疾病的模型². 饮用含有3% DSS的水进行一次为期四天的处理后，小鼠会出现急性结肠炎的症状，包括体重减轻、血便和腹泻。在处理疗程结束时将小鼠安乐死，尸检后分离结肠并进行处理，可将其“瑞士卷式”包埋³以便对整个结肠进行显微镜分析，或以“香肠”形式灌注福尔马林以进行肉眼分析。随后将组织包埋于石蜡中，切片并染色，用于组织学评估。

方案

第一部分：损伤-修复性结肠炎模型

1. 在开始DSS处理之前，应获取每只小鼠的基线体重。
2. 将Dextran Sulfate Sodium Salt溶于水，配制成3% (w/v) 溶液，并使用0.45 μm醋酸纤维素滤膜过滤。
3. 将小鼠笼中的饮用水更换为3% DSS溶液，持续四天。在此期间，小鼠不应接触任何其他水源（例如，在自动供水系统上安装防舔水嘴）。
4. 第四天时，将DSS溶液更换为普通水，持续额外三天，以允许结肠上皮部分恢复。应在第四天对小鼠进行称重，以量化结肠炎引起的全身性影响。严重损伤时常出现体重下降。
5. 第七天，称重后处死小鼠。可采用异氟烷吸入过量法或其他经机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方法实施安乐死。

第二部分：尸体解剖与结肠采集

1. 将小鼠腹侧朝上固定，并固定四肢以确保腹部操作区域无障碍。用70%乙醇彻底润湿腹部。
2. 用组织镊夹住腹部正中线并向上牵拉，使皮肤隆起。使用尖头剪刀切开腹腔，暴露腹腔内容物。将切口向上延伸至剑突中点，再沿两侧肋缘下方向外侧延伸。
3. 辨认小肠、盲肠和结肠。仔细从周围肠系膜中分离结肠。在骨盆深处横断结肠，游离远端结肠和直肠；在结肠-盲肠交界处横断结肠，游离近端结肠。操作过程中需格外小心，避免损伤结肠，若发生穿孔将导致结肠清洗困难。
4. 使用20G喂养针和10 ml注射器，对结肠进行插管，并用冰冻PBS冲洗，直至流出液完全无粪便残留。
5. 此时，若需进行解剖显微镜下的大体分析，可将结肠固定成“香肠状”。若仅需进行组织学分析，则继续进行第4部分“制备用于急性结肠炎组织学分析的瑞士卷（Swiss Rolls）”。

第3部分：将结肠整体加工成“香肠状”以进行宏观分析

1. 保持结肠的正确方向非常重要，因此应将结肠远端靠近操作者放置。剪取两段不可吸收缝线（SP116 1.5 metric braided silk），一段长约1英寸，另一段长约2英寸。
2. 使用2英寸长的缝线，在尽可能靠近边缘的位置结扎远端，同时确保密封良好。
3. 将一支含有5 ml 10%磷酸盐缓冲福尔马林的20G喂养针插入结肠近端。在喂养针球部近端稍前方，用剩余的缝线松松打结。用手牢固握住喂养针球部位置的结肠，注入福尔马林直至结肠充分扩张。拔出喂养针的同时收紧缝线打结，使注入福尔马林后扩张的结肠呈“香肠状”。
4. 取一支15 ml锥形管，装入10%磷酸盐缓冲福尔马林，将结肠放入管中，固定24小时。
5. 倒掉福尔马林，加入70%乙醇继续固定24小时。（结肠可在室温下长期保存于70%乙醇中。）
6. 从锥形管中取出结肠，用手术刀小心剪去两端的缝线，注意避免损伤结肠组织。请注意，远端保留的缝线较长。沿结肠长轴从远端向近端纵向剪开，使其展平成一片长条状组织。此时可将结肠置于解剖显微镜下观察。

第4部分：制备用于急性结肠炎组织学分析的瑞士卷

1. 保持结肠的正确方向至关重要，因此应使结肠远端靠近操作者。
2. 测量结肠长度。该指标是评估损伤严重程度的另一依据。结肠炎会引发水肿，导致结肠总长度缩短。
3. 使用尖头剪刀，从结肠远端向近端纵向剪开。用尖头镊子夹住切口两侧边缘，向侧方打开，逐步向远端分离。>近端，从而将结肠展平呈片状。
4. 卷曲结肠需要使用一对镊子并采用双手操作技术。用镊子夹住远端边缘的任意一侧，通过旋转并间歇松开镊子，依次将结肠从远端向近端卷起，从而形成具有三维结构的螺旋状“瑞士卷”形态。为保持卷曲形状，用镊子牢固夹住卷状组织，并使用27G1/2针头横穿组织进行切割。当针头穿出卷状组织时，将其弯曲固定以确保针头位置稳定。
5. 将组织卷放入适当标记的组织包埋盒中，置于盛有10%磷酸盐缓冲甲醛溶液的容器内，室温下固定24小时，以确保组织充分固定。
6. 倒掉甲醛，加入70%乙醇继续固定24小时。（结肠组织可在70%乙醇中室温长期保存。）
7. 样本固定后，可进行石蜡包埋、切片并置于载玻片上，以供组织学分析。

第5部分：代表性结果

用于急性结肠炎的DSS模型可使研究人员获取、固定并分析模拟急性结肠炎的结肠组织。当正确进行瑞士卷（Swiss roll）包埋并切片贴片时，应形成能够代表整个结肠的切面（图1）。贴片后的结肠卷可进行苏木精和伊红（H&E）染色，以评估结肠从远端（内侧）到近端（外侧）的损伤程度（图2）。此外，也可对瑞士卷切片进行免疫组织化学染色，以识别和定量炎性细胞浸润。若香肠法（sausage method）操作正确，固定后的结肠将呈现扩张状态，整个黏膜表面可被轻松操作，并可在解剖显微镜下清晰观察（图3）。

图1. 正确操作的“瑞士卷”法。（A）结肠从远端向近端卷起，用针横穿并弯曲针尖固定。随后将其放入组织包埋盒中进行固定。（B）经DSS处理的小鼠结肠制成的“瑞士卷”5 μm切片，经H&E染色（d=远端结肠，p=近端结肠）。

图2. 经DSS处理的结肠表现出急性结肠炎的迹象。与水处理对照组相比，DSS处理组结肠中可见明显的炎症和隐窝损伤。

图3. 一个“香肠状标本”的示例。该香肠已注入甲醛并完全膨胀。由于结肠的自然弯曲，会存在轻微的角度。打开后的香肠状标本应平铺放置。

讨论

该方案可进行修改，以模拟急性损伤、损伤-修复或慢性结肠损伤过程。

急性损伤处理：

自由饮用DSS处理4-6天后立即处死

损伤-修复修饰：

使用DSS处理4-6天造成损伤，随后进行3-4天的恢复期，最后处死动物（如上述方案所述）。

慢性结肠炎改良法：

小鼠接受三个周期的3% DSS处理，每个周期持续五天，每两个周期之间间隔十六天恢复期。在最后一个16天休息期结束后，处死小鼠。

研究人员在使用此模型时需要注意以下几个问题：

1. 损伤部位的变异性：在我们的实验中，损伤主要发生在结肠远端，而近端结肠和盲肠相对较少受累。其他研究者则报道损伤模式以近端为主。
2. 环境因素的变异性：存在显著的环境差异，这可能部分归因于肠道微生物群、饮食及...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硫酸葡聚糖钠盐	USB Corp., Affymetrix	9011-18-1	分子量 40,000-50,000
10% 磷酸缓冲福尔马林	费舍尔科技公司	SF100-4
异氟烷，USP	凤凰制药公司	NDC 57319-474-06
TISSUE PATH 大号组织包埋盒	费舍尔科技公司	15182706
BD 10 ml 注射器	BD 生物科学公司	309604
乙醇	Pharmco-AAPER	E190	用蒸馏水稀释至 70%
20G 直型饲喂针头	VWR 国际公司	20068-612
27G1/2 PrecisionGlide 针头	BD 生物科学公司	305109
解剖剪刀（尖头/钝头）	VWR 国际公司	82027-588
沃氏镊	VWR 国际公司	82027-428
不可吸收缝合线	LOOK 外科公司	SP116
Whatman 印迹纸	VWR 国际公司	28298-020	按需裁剪
Nalgene 无表面活性剂醋酸纤维素（SFCA）滤膜	科尔-帕默公司	EW-06731-2
碳纤维复合材料数显卡尺	费舍尔科技公司	15-007-958