本文展示了一种从植物材料中分离特定细胞类型的实验方法。该技术利用在特定细胞类型中表达荧光蛋白的转基因标记品系，结合细胞解离和荧光激活细胞分选技术进行细胞分离。此外，本文还建立了一种生长体系，便于在细胞分选前对Arabidopsis thaliana幼苗进行处理。
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摘要
摘要
对基因表达进行高分辨率、特定细胞类型的分析，能够极大提升对多细胞生物发育调控机制以及环境刺激响应的理解。原位杂交和报告基因可视化在一定程度上可用于此类研究，但若要实现高分辨率的定量RT-PCR或高通量的全转录组分析，则必须从特定细胞类型中分离RNA。通过对在特定细胞类型中表达荧光蛋白标记的组织进行细胞解离，继而进行荧光激活细胞分选（FACS），即可获得足量的材料用于RNA提取、cDNA合成/扩增以及微阵列分析。
植物研究领域已拥有一系列丰富的细胞类型特异性荧光报告基因品系。本实验采用两种拟南芥（Arabidopsis thaliana）根部标记品系：PSCR::GFP（标记内皮层和静止中心）和 PWOX5::GFP（标记静止中心）。通过水培法或琼脂平板培养大量（数千株）幼苗，并收集足够的根组织用于后续分析。植物组织的细胞解离通过酶解细胞壁实现。该过程利用高渗透压诱导的质壁分离，结合 commercially available 纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶，将原生质体释放到溶液中。
利用488 nm激光激发原生质体后，绿色荧光蛋白阳性细胞的流式细胞分选依赖于其绿色与红色发射光谱的可视化区分。GFP阳性原生质体可通过其更高的绿光与红光发射比进行识别。原生质体通常直接分选至RNA提取缓冲液中，并储存以供后续实验使用。
该技术被证明是简单且可行的。此外，结果表明，即使对于极为稀少的细胞类型（例如 静止中心细胞），也可轻松分离出足够数量的细胞用于转录组分析。最后，本文展示了一种拟南芥幼苗的培养体系，可在细胞分选前方便地对植株进行处理（例如 用于细胞类型特异性的生物或非生物胁迫响应分析）。文中还讨论了植物原生质体FACS技术可能的其他补充应用。
方案
1）植物材料的准备
- 原生质体可以从多种不同的植物物种和组织中获得，前提是使用了合适的细胞壁消化酶混合物。1在开展大规模实验之前，建议先进行小规模的材料消化，以评估组织、酶等的原生质体分离效率，并估算用于细胞分选的阳性细胞百分比。此处，所用原生质体来源于根组织 拟南芥 表达绿色荧光蛋白（GFP）的幼苗被用于细胞类型特异性标记。内皮层和静止中心被标记 PSCR::GFP 以及静止中心 PWOX5::GFP2,3 （图1）。
- 幼苗在植物培养托盘（Sigma；图2a）中的尼龙滤膜上进行水培培养250 μm 筛网；NITEX），使根部穿过并伸入生长培养基（0.22% w/v Murashige 和 Skoog 基本培养基 [Sigma]，1% w/v 蔗糖，0.05% w/v MES [2-(N-吗啉代)乙磺酸]，用 KOH 调节 pH 至 5.7）。 Alternatively，植物也可生长在尼龙滤膜上方（100 μm 在垂直放置的1%琼脂平板中（图2b）。
- 上述滤器的使用不仅有助于根系的收获，还便于根据需要对幼苗进行进一步处理。这些滤器可使幼苗轻松转移 大规模 转移到添加了特定催化剂的新植物培养皿或琼脂平板上。例如，该植物培养皿系统已用于拟南芥幼苗对氮处理的转录响应进行细胞类型特异性分析4.
- 在显微镜下确认荧光标记正确表达（尤其是在使用处理方案时，因为细胞类型特异性标记物本身可能受到处理的影响）。在此情况下，使用荧光显微镜（Nikon；图1）观察幼苗。需注意，细胞类型特异性荧光标记品系应首先在共聚焦显微镜下进行表征，以准确确定被标记的细胞类型并评估表达的变异性。
2）原生质体制备液的配制
- 在去离子水中溶解 1.25% w/v 纤维素酶（Yakult）、0.3% w/v 果胶酶（Yakult）、0.4 M D-甘露醇、20 mM MES 和 20 mM KCl（来自 1 M 储液），并用 1 M Tris/HCl pH 7.5 调节 pH 至 5.7。此溶液将略显浑浊。
- 将溶液加热至 55°C 持续 10 分钟（溶液将变为澄清），然后冷却至室温，再加入 0.1% w/v BSA（牛血清白蛋白）、10 mM CaCl2 和 5 mM β-巯基乙醇。
3）植物材料的收获与原生质体制备
- 用解剖刀将根从尼龙网上刮下，收集到含有原生质体分离溶液的烧瓶中。通常每1,500株幼苗的根使用10 ml原生质体分离溶液。
- 轻轻摇动锥形瓶（75 rpm），室温孵育1小时。延长孵育时间可能会提高原生质体产量，但也可能增强原生质体制备过程本身对基因表达的影响。
- 用滤器过滤原生质体溶液 40 μm 细胞滤筛（BD Falcon）并将溶液分装至15 ml圆锥形离心管（BD Falcon）中。
- 在摆桶式离心机中以500 G离心10分钟。请注意，离心速度取决于所用原生质体的类型、其脆弱性以及酶解处理过程中产生的细胞碎片量。
- 吸除大部分上清液，用残留的溶液重悬原生质体，并在显微镜下观察（图3）。
- 使用血细胞计数板估算原生质体的数量和密度。细胞密度将决定样品注入速度、每秒事件数，以及因此在FACS分选细胞所需的总时间（另见第4.3节）。
- 3.7) 可直接进行FACS分析，或用孵育溶液（如W5溶液（154 mM NaCl，125 mM CaCl₂，5 mM KCl，5 mM MES，用KOH调节pH至5.7））或不含添加酶的原生质体分离溶液洗涤并重悬原生质体。尤其是在研究转录变化时，应尽量减少样本暴露于可能影响基因表达的条件（例如更换原生质体所处的缓冲液）中。因此，建议将原生质体保留在原生质体分离溶液中，并尽快进行FACS分析。
4) 原生质体的荧光激活细胞分选
- 开启并准备细胞分选仪。此处使用的是 FACSAria（BD）。
- 设置流体系统，采用 100 μm 喷嘴和 20 psi 的鞘液压力。
- 可根据实验需求调整细胞密度和样品进样速度，以优先获得最高得率或最快分选速度。我们已成功对浓度高达 10,000,000 个细胞/mL 的样品进行分选。
- 在 FACS 上启用样品振荡功能，以防止原生质体沉降。若出现 FACS 堵塞问题，可采取以下三种可能的故障排除措施：1. 对样品管路执行反向冲洗；2. 稀释原生质体悬液以降低密度；3. 在离心和重悬后重复过滤步骤（3.3），以进一步纯化原生质体溶液。
- 配置仪器以检测前向散射光（FSC）、侧向散射光（SSC），以及在 488 nm 激光激发后于 530/30 nm 处检测 GFP 荧光信号、在 610/20 nm 处检测红色光谱自发荧光（RSA）。这些参数本质上是用于分离 GFP 阳性原生质体的唯一依据。本实验中电压设置如下：FSC — 60 V，SSC — 250 V，GFP — 350 V，RSA — 335 V。请注意，最佳电压设置因每台 FACS 仪器而异，且在细胞分选仪的使用生命周期中可能需要不断调整。
- 首先建立前向散射光与侧向散射光的散点图。调整电压设置，使检测到的事件集中在图中区域。
- 接下来，建立绿色荧光与红色荧光信号的散点图。调整电压设置，当检测野生型（非 GFP）原生质体悬液时，使检测事件在图中形成一条居中的对角线分布群体。来自 GFP 标记品系的原生质体悬液将产生一个明显的绿色荧光事件群体，该群体在野生型样品中从未出现。
- 设置补偿参数，以校正 GFP 与 RSA 之间的光谱重叠。正确的补偿设置有助于更好地将 GFP 阳性原生质体与非 GFP 原生质体及碎片区分开来。本实验所用补偿参数如下：RSA 减去 17.91% 的 GFP 信号。
- 设置门控以识别 GFP 阳性事件，应使用非 GFP 原生质体的阴性对照来辅助确定门控边界（图 4）。
- 设置前向散射光的截断阈值，以排除小碎片对分析的干扰。通过在 FSC 与 SSC 图中观察 GFP 阳性事件，帮助确定截断阈值的位置。本实验中截断值设为 5,000。请注意，FACS 会将碎片计为分选事件，若样品中碎片含量较高，则测得的 GFP 阳性事件百分比可能与预期不符。这并非一定是问题，但样品中碎片越多，分选所需时间越长。
- 根据实验目的及待分析细胞类型的丰度，将 FACS 的分选精度模式设置为“最佳得率”或“最佳纯度”。
- 对于 RNA 提取，预先在收集管（1.5 ml 微量离心管）中加入适量 RNA 提取缓冲液。在此设置下，20,000 个分选事件产生的总体积约为 100 μl，将其分选至 350 μl 提取缓冲液中（RNeasy micro 试剂盒，QIAGEN）。分选完成后应混匀样品，以防细胞悬液聚集在管顶。
- 样品可储存后处理，也可直接进行 RNA 提取。已成功利用仅 500 个分选事件所提取的 RNA 完成微阵列分析。本实验中使用了 RNeasy micro 提取试剂盒（QIAGEN）、WT-Ovation Pico RNA 扩增系统以及 FL-Ovation cDNA Biotin Module V2（NuGEN）。
代表性结果
一个约含1,500株一周龄的植株培养盘 PSCR::GFP 幼苗获得约 60,000 个原生质体（通过血细胞计数板测定）。在 65,000 个经 FACS 处理的事件中，2.6% 被判定为 GFP 阳性并被分选（图 4b）。
八块培养板，每块约含1,500株四天龄的PWOX5::GFP幼苗（总计12,000株），共获得约30,000,000个原生质体（通过血细胞计数板测定）。在16,000,000个经FACS处理的事件中，0.063%被定义为GFP阳性，并进行了分选（图4c）。
通常使用 10,000 个分选后的细胞进行 RNA 提取，可获得 20 至 140 ng 总 RNA（图 5）。
图1. 细胞类型特异性GFP标记品系在 拟南芥 根 荧光显微镜图像采用配备微分干涉差（DIC）和GFP滤光片的Eclipse 90i显微镜（Nikon）拍摄，显微镜运行Metamorph软件（Molecular Devices）。为便于观察，将DIC图像与GFP图像进行叠加。本视觉实验中使用的两条标记线如图所示；a) PSCR::GFP 以及 b) PWOX5::GFP.
图 2. 植物生长条件。 幼苗在环境控制条件下通过水培法在植物培养盒（a）或垂直放置的琼脂平板（b）上生长。
图3. 表达GFP的植物原生质体。 使用配备微分干涉差（DIC）和GFP滤光片的Eclipse 90i显微镜（Nikon）在Metamorph软件（Molecular Devices）控制下采集荧光显微图像。为便于可视化，将DIC图像与GFP图像进行叠加。箭头指示破裂的细胞、细胞碎片以及GFP阳性的原生质体。两条白线之间的距离为50 μm。
图 4. GFP 阳性原生质体的荧光激活细胞分选。 来自野生型（a）、PSCR::GFP （b）或 PWOX5::GFP （c）标记品系的原生质体，使用 FACSAria（BD）进行分析与分选，分选门控基于绿色荧光（530/30 nm；x 轴）与红色荧光（610/20 nm；y 轴）的点状图设定。每张图显示 100,000 个事件。位于 GFP 分选门控范围内的事件以绿色高亮显示。
图5. 从10,000个分选细胞中提取RNA的代表性结果。 细胞直接分选至RNA提取缓冲液（QIAGEN）中，随后纯化RNA，并使用2100 Bioanalyzer（Agilent）检测其浓度、纯度和完整性。两种标记细胞系均显示三个重复样本。
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讨论
原则上，原生质体可来源于多种植物组织，优化有利条件将显著提高RNA的质量和数量。原生质体制备溶液以及所用的选择性孵育缓冲液均会影响这一方面。
可根据所用流式细胞分选仪（FACS）的功能选择多种不同的荧光蛋白， 例如 GFP、RFP、YFP、CFP 或其众多变体和衍生物。这些标记基因的表达不仅可由细胞类型特异性启动子或增强子捕获元件驱动（如此处所示），也可由您选定的启动子驱动。 例如 一种激素响应型合成报告基因5植物原生质体的双色流式细胞术也是可行的。例如，在使用带有荧光阳性筛选标记的载体进行瞬时转化实验时，可应用该方法。5.
原生质体也可用于基因组DNA、蛋白质或代谢物分析的分选6。由于原生质体结构脆弱，分选后保持其存活具有挑战性；使用较大口径（130 μm）的喷嘴、较低的鞘液压力，并将其分选至优化的培养缓冲液中，可提高分选后原生质体的存活率。
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致谢
本工作得到了美国国家科学基金会（资助号：DBI 0519984）和美国国立卫生研究院（资助号：5R01GM078279）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 250 μm 尼龙筛网 | Sefar Filtration | NITEX 03-250/50 | |
| 100 μm 尼龙筛网 | Sefar Filtration | NITEX 03-100/47 | |
| 方形培养皿 | Fisher Scientific | 08-757-10k | |
| Phytatrays | Sigma-Aldrich | P1552 | |
| Murashige 和 Skoog 基本培养基（MS） | Sigma-Aldrich | M5519 | |
| 蔗糖 | Fisher Scientific | S5-3 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | 10 M 储存液 |
| Eclipse 90i 显微镜 | Nikon Instruments | ||
| 纤维素酶 R-10 | Yakult Pharmaceutical | ||
| 离析酶 R-10 | Yakult Pharmaceutical | ||
| D-甘露醇 | Sigma-Aldrich | M9546 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P8041 | 1 M 储存液 |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| β-巯基–乙醇 | Calbiochem | 444203 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C2536 | 1 M 储存液 |
| 旋转摇床 | Labline Instruments | ||
| 40 μm 细胞筛 | BD Biosciences | 352340 | |
| 15 ml 锥形离心管 | BD Biosciences | 352196 | |
| 台式离心机 | Sorvall, Thermo Scientific | Legend RT | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| FACSAria | BD Biosciences | ||
| 1.5 ml 微量离心管 | VWR international | 20170-38 | |
| RNeasy 微量试剂盒 | Qiagen | 74004 | |
| WT-Ovation Pico RNA 扩增系统 | NuGEN | 3300_12 | |
| FL-Ovation cDNA 生物素模块 V2 | NuGEN | 4200_12 |
参考文献
- Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 127, 1466-1475 (2001).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127, 595-603 (2000).
- Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots. Nature. 433, 39-44 (2005).
- Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 803-808 (2008).
- Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. Positive fluorescent selection permits precise, rapid, and in-depth overexpression analysis in plant protoplasts. Plant Physiol. 149, 1231-1239 (2009).
- Petersson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis. Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).
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