光镜研究沉默突触的突触前

Summary

谷氨酸突触主动模式可以切换到无声模式。我们证明，在啮齿类动物神经细胞的分离文化突触前的活动状态的可视化使用一个可修复的FM1 -​​ 43染料形式活跃的突触形象化vGluT - 1抗体免疫可视化所有谷氨酸突触。

Abstract

突触可塑性的神经系统的学习和记忆能力，否则，防止成为神经毒性损害的侮辱，也可能代表一个适应性的可能的基础。我们一直在研究一种突触前可塑性，是有趣的部分，因为它是一个数字切换和关闭突触前终端的能力，包含神经递质谷氨酸释放囊泡表示。在这里，我们展示了一个可视化的文化准备从啮齿类动物海马突触前在分离细胞终端的活动状态的协议。该方法依赖于检测用的可修复形式的苯乙烯基染料FM1 -​​ 43常用标签突触小泡，染色积极突触。针对囊泡膜谷氨酸转运体1（vGluT 1），染色设计无论激活状态标签的所有谷氨酸突触的抗体相比，同一终端的免疫染色轮廓。我们发现，去极化刺激诱发突触前的沉默。突触是无声的基准条件下的人口可以被激活电气长时间沉默，或通过cAMP信号通路的激活。

Protocol

文化准备

1. 准备从出生后¹ 0到3动物大鼠或小鼠海马细胞分离细胞培养。我们的神经元坚持一个基本的星形胶质细胞单层，这反过来又坚持一个0厚度盖玻片上传播的胶原蛋白层。板的神经元密度约每平方厘米500细胞。
2. 允许的文化成长，让突触的发育和成熟10-14天。治疗在体外4天的文化与抗有丝分裂ARAC逮捕进一步胶质增长。饲料在体外5 Ne​​urobasal中加B27的补充，以提高神经元的存活与在一天半的介质交换。
3. 文化期间，推出旨在改变功能沉默突触数量的治疗。我们发现，沉默了很大比例的谷氨酸突触（〜80％）的一个便捷的途径是与30毫米钾的4小时的治疗。更长的孵化与弱的去极化刺激诱 ​​导类似^的沉默2。可以使用4小时与50微米，激活腺苷酸环化酶，forskolin的刺激，唤醒沉默终端的人口^在基线3。

沉默突触的可视化

1. 细胞在体外10-14日与分离神经炎过程中的一个相对较低的密度，以便用荧光显微镜的离散突触终端的可视化。
2. 蒸馏水中，准备了5毫米，FM1 -​​ 43FX原液。股票应保持在黑暗中，在4 ° C。所有使用FM1 -​​ 43FX的实验也应在黑暗中进行。
3. 挑战一个HEPES缓冲液含有100毫米氯化钠，氯化钙2毫米，1毫米氯化镁，10毫米的葡萄糖，和10μm，FM1 -​​ 43FX的解决方案与45毫米氯化钾2分钟文化。该解决方案还应该包含1微米NBQX和25微米的D - APV阻断突触后受体，防止反复的信号。这一挑战将标签的胞外分泌和内吞作用的突触终端。设计的挑战，时间和强度，造成至少一轮的回收池⁴所有可用的囊泡的胞吐。但是，面临的挑战是不充分，造成额外的终端沉默。
4. 使用相同的HEPES缓冲生理盐水没有氯化钾，但与500微米Advasep - 7消除非特异性的染料洗净的文化，只有3到5秒。请注意，这一步的时间将结果在所有FM1 -​​ 43FX标签的损失是长期应用Advasep - 7的关键。在下一步洗HEPES缓冲没有Advasep - 7生理盐水5个2分钟的时间间隔。
5. 4％多聚甲醛和10分钟，PBS，pH 7.4的0.2％戊二醛固定细胞。简单，用PBS洗细胞一次，然后15分钟的PBS封闭液中含有4％正常山羊血清和0.04％的Triton X - 100的孵化。需要注意的是，FM1 -​​ 43FX的Triton X - 100的的用在这里和在以后的步骤也很敏感。 FM1 -​​ 43FX标签一般来说，最好是在没有任何TRITON X - 100，但一些清洁剂是必要的通透随后的免疫细胞。我们有决心经验，0.04％的Triton X - 100的是突触前沉默突触检查的最佳选择。
6. 稀释阻塞在浓度为1:2500的解决方案的主要vGluT - 1抗体。轻轻摇动/稀释vGluT - 1抗体在室温下3小时旋转培养的细胞。一定要盖培养皿用铝箔，以防止FM1 -​​ 43FX染料脱色。
7. 在PBS清洗细胞两次，然后孵化与抗豚鼠抗体结合FM1 -​​ 43FX不同的光谱特性与荧光基团，以区分这两个污渍细胞。我们的实验中，我们将在1:500使用Alexa的555标记的抗豚鼠抗体阻断溶液。孵化与二级抗体的细胞，而30分钟，在室温下摇晃。
8. 四个次以上的PBS清洗细胞，然后装入使用Fluoromount - G的小水滴在玻璃幻灯片的盖玻片。请务必以盖玻片，使细胞面临的幻灯片。允许的幻灯片干通宵。
9. 现在我们准备收购的活跃和不活跃的突触图像。 1.4在激光共聚焦显微镜的数值孔径，准备一个60 ×油的目标。在舞台上放置一个幻灯片，确保盖玻片一边是面临的客观。聚焦的幻灯片后，找到的突起，是不是过于密集的领域。它还建议，以避免附近的细胞胞体成像，甚至可以保持广泛的洗涤后有残留FM1 -​​ 43FX染料。对于我们的实验图像，我们通常会放大到51微米的领域大小。
10. 收购一个Z堆栈一个给定的领域涵盖了27 0.3微米步骤7.8微米的深度。这个范围足以涵盖在我们的文化中突起的厚度。 Z - Stack的每一步，先用扫描的激光激发免疫vGluT - 1抗体，以确定在显微镜领域的所有谷氨酸突触。同一领域FM1 -​​ 43FX荧光的每一步重新扫描。中性密度​​过滤和一个给定的实验所有盖玻片之间的光电倍增管的收益始终设置，同时避免了信号的饱和度。我们通常会获得每个实验条件≥5个领域。
11. 使用分析软件，转换成一个综合的单一平面图像的Z - Stack。使用这种转换的过程中，我们生产的基础上，从任何飞机在每个像素的最大强度的形象。阈值和vGluT - 1端子没有参考，FM1 -​​ 43FX染色分析，确定了复合图像。染区，简称为puncta，被标记为感兴趣区域。我们通常选择10％的领域puncta。下一步，FM1 -​​ 43FX通道阈值和感兴趣的区域叠加。分析软件是用于量化每个信号的荧光强度，以及每个punctum的面积。可以用一个绝对像素标准或百分比的像素标准，以区别于活跃不活跃的突触。

代表性的成果

1. 在我们的文化，我们发现70-80％的谷氨酸突触，vGluT - 1染色的定义，表现出检测到，FM1 - 43 ^{染色2，6-8} 。在重叠的图像，FM1 -​​ 43绿色荧光和红色vGluT - 1染色，这是大量黄色puncta反映:与合作本地化标记突触。这些箭头表示。
2. （红色）vGluT - 1阳性puncta约有20-30％会失败（绿色），FM1 -​​ 43荧光基线以上。这些都是不活跃的突触前终端，一个例子是由箭头指示。
3. 也将观察到的突触的第三次人口。这些都是积极的（绿色）FM1 -​​ 43（红色）vGluT - 1染色的荧光，但缺乏。这些都是积极的GABA能突触，一个例子是由星号表示。这些被排除在外，从我们的分析，但可以明确地使用一个水疱的GABA转运体抗体vGluT - 1抗体进行研究。

Discussion

意义

1. 突触通常被认为是释放与一个可衡量的概率的发射机操作。自己和他人的工作，使得它显然有些突触难治性释放神经递质，尽管水泡神经递质转运和其他关键的突触^{前标记2，6-8}全套。以前我们已经表明，在基底神经元网络活动是至关重要的，以保持这种不活跃的突触的人口。

关键步骤

1. 列入一个500微米Advasep - 7的简短洗显着增强，FM1 -​​ 43FX染色质量。然而，即使在此洗超过5秒的时间略有增加，会造成损失，FM1 -​​ 43FX标签。
2. FM1 -​​ 43FX是非常敏感的TRITON X - 100在免疫部分的协议数量。 FM1 -​​ 43FX标签最好是在没有任何TRITON X - 100，但一些清洁剂是必要通透vGluT - 1免疫细胞的。我们有决心，0.4％的Triton X - 100的经验是突触前沉默突触检查的最佳选择。

修改

1. 我们可以使用一个作为^第三染色，以确保vGluT...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
FM1-43FX	Invitrogen	F-35355	红移 FM4-64FX 也可用，但尚未证明适合突触前沉默的测定。
Advasep-7	CyDex	AR-0A7-001
vGluT-1	EMD Millipore	AB5905
Alexa 647 偶联的抗 GP	Invitrogen	A-21450
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01