用光学显微镜研究突触前沉默突触

摘要

谷氨酸能突触可从活动状态转换为沉默状态。我们证明了在分离培养的啮齿类动物神经元中，可通过可固定的FM1-43染料标记来显示活动性突触，同时结合vGluT-1抗体免疫染色以显示所有谷氨酸突触，从而可视化突触前活动状态。

摘要

突触可塑性可能是神经系统具备学习与记忆能力的基础，也可能代表了一种适应性机制，可防止原本具有损伤性的刺激转变为神经毒性。我们一直在研究一种突触前可塑性形式，其引人关注的原因之一在于，它表现为突触前终末释放含神经递质谷氨酸囊泡能力的数字式开关调控。本文中，我们展示了一种用于可视化观察分离培养的啮齿类动物海马神经元中突触前终末活动状态的实验方案。该方法依赖于使用可固定的苯乙烯类染料FM1-43对活跃突触进行标记，该染料常用于标记突触囊泡。随后将该染色结果与使用抗囊泡谷氨酸转运体1（vGluT-1）抗体对相同突触前终末进行的免疫荧光染色进行比较，后者旨在标记所有谷氨酸能突触，而不论其激活状态如何。我们发现，去极化刺激可诱导突触前沉默。在基础条件下处于沉默状态的突触群体，可通过长时间的电沉默或激活cAMP信号通路而被唤醒。

方案

培养物制备

1. 从出生后第0至第3天的大鼠或小鼠中制备海马细胞的离散细胞培养物¹。我们的神经元附着在底层的星形胶质细胞单层上，而星形胶质细胞则附着在涂布于0号厚度盖玻片上的胶原层上。以每平方厘米约500个细胞的密度接种神经元。
2. 培养10至14天，以促进突触的发育和成熟。在体外培养第4天使用抗有丝分裂剂AraC处理，以抑制胶质细胞的进一步生长。在体外培养第5天，用Neurobasal培养基加B27补充剂进行半量换液，以提高神经元存活率。
3. 在培养期间，引入旨在改变功能沉默突触数量的处理方式。我们发现，一种简便的方法是使用30 mM钾处理4小时，可使大部分（约80%）谷氨酸能突触沉默。较长时间孵育但较弱的去极化刺激也可诱导类似的沉默效应²。使用50 μM forskolin（腺苷酸环化酶激活剂）刺激4小时，可用于唤醒基础状态下沉默的终末群体³。

可视化沉默突触

1. 体外培养第10至14天时，细胞应保持相对较低的密度，并具有清晰分离的神经突过程，以便通过荧光显微镜清晰观察到独立的突触终末。
2. 用蒸馏水配制5 mM FM1-43FX储备液。储备液需避光保存于4°C。所有使用FM1-43FX的实验也必须在避光条件下进行。
3. 用含45 mM氯化钾的HEPES缓冲盐溶液对培养物刺激2分钟，该溶....

讨论

意义

1. 通常认为，突触通过以可测量的概率释放递质来发挥作用。我们及其他研究者的工作表明，尽管某些突触具备完整的囊泡神经递质转运蛋白和其他关键的突触前标志物，但仍对神经递质的释放呈不应状态^{2, 6-8}。我们先前已证明，神经元中的基础网络活动对于维持这类非活性突触群体至关重要。

关键步骤

1. 使用 500 μM Advasep-7 进行短暂洗涤可显著提高 FM1-43FX 染色的质量。然而，该洗涤步骤的时间即使略微超过 5 秒，也会导致 FM1-43FX 标记的丢失。
2. FM1-43FX 对免疫染色步骤中所用 Triton X-100 的用量非常敏感。在完全不使用 Triton X-100 的情况下，FM1-43FX 标记效果最佳；但为了实现细胞通透以进行 vGluT-1 免疫染色，仍需使用一定量的去污剂。我们通过实验确定，0.4% Triton X-100 是检测突触前沉默突触的最佳浓度。

修改

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
FM1-43FX	Invitrogen	F-35355	红移的 FM4-64FX 也可获得，但其在突触前沉默检测中的适用性较差。
Advasep-7	CyDex	AR-0A7-001
vGluT-1	EMD Millipore	AB5905
Alexa 647 标记的抗 GP 抗体	Invitrogen	A-21450
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01