谷氨酸能突触可从活动状态转换为沉默状态。我们证明了在分离培养的啮齿类动物神经元中，可通过可固定的FM1-43染料标记来显示活动性突触，同时结合vGluT-1抗体免疫染色以显示所有谷氨酸突触，从而可视化突触前活动状态。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
突触可塑性可能是神经系统具备学习与记忆能力的基础，也可能代表了一种适应性机制，可防止原本具有损伤性的刺激转变为神经毒性。我们一直在研究一种突触前可塑性形式，其引人关注的原因之一在于，它表现为突触前终末释放含神经递质谷氨酸囊泡能力的数字式开关调控。本文中，我们展示了一种用于可视化观察分离培养的啮齿类动物海马神经元中突触前终末活动状态的实验方案。该方法依赖于使用可固定的苯乙烯类染料FM1-43对活跃突触进行标记，该染料常用于标记突触囊泡。随后将该染色结果与使用抗囊泡谷氨酸转运体1（vGluT-1）抗体对相同突触前终末进行的免疫荧光染色进行比较，后者旨在标记所有谷氨酸能突触，而不论其激活状态如何。我们发现，去极化刺激可诱导突触前沉默。在基础条件下处于沉默状态的突触群体，可通过长时间的电沉默或激活cAMP信号通路而被唤醒。
方案
培养物制备
- 从出生后第0至第3天的大鼠或小鼠中制备海马细胞的离散细胞培养物1。我们的神经元附着在底层的星形胶质细胞单层上，而星形胶质细胞则附着在涂布于0号厚度盖玻片上的胶原层上。以每平方厘米约500个细胞的密度接种神经元。
- 培养10至14天，以促进突触的发育和成熟。在体外培养第4天使用抗有丝分裂剂AraC处理，以抑制胶质细胞的进一步生长。在体外培养第5天，用Neurobasal培养基加B27补充剂进行半量换液，以提高神经元存活率。
- 在培养期间，引入旨在改变功能沉默突触数量的处理方式。我们发现，一种简便的方法是使用30 mM钾处理4小时，可使大部分（约80%）谷氨酸能突触沉默。较长时间孵育但较弱的去极化刺激也可诱导类似的沉默效应2。使用50 μM forskolin（腺苷酸环化酶激活剂）刺激4小时，可用于唤醒基础状态下沉默的终末群体3。
可视化沉默突触
- 体外培养第10至14天时，细胞应保持相对较低的密度，并具有清晰分离的神经突过程，以便通过荧光显微镜清晰观察到独立的突触终末。
- 用蒸馏水配制5 mM FM1-43FX储备液。储备液需避光保存于4°C。所有使用FM1-43FX的实验也必须在避光条件下进行。
- 用含45 mM氯化钾的HEPES缓冲盐溶液对培养物刺激2分钟，该溶液包含100 mM氯化钠、2 mM氯化钙、1 mM氯化镁、10 mM葡萄糖和10 μM FM1-43FX。此溶液还应含有1 μM NBQX和25 μM D-APV，以阻断突触后受体并防止重复信号传递。该刺激可标记具有胞吐和胞吞能力的突触终末。刺激时间和强度设计为诱导回收池中所有可利用囊泡至少完成一轮胞吐4。然而，该刺激强度不足以导致额外的突触终末沉默。
- 仅用不含氯化钾但含500 μM Advasep-7的相同HEPES缓冲盐溶液洗涤培养物3至5秒，以去除非特异性染料5。请注意，此步骤的时间极为关键，因为长时间使用Advasep-7会导致所有FM1-43FX标记丢失。随后用不含Advasep-7的HEPES缓冲盐溶液洗涤五次，每次2分钟。
- 用含4%多聚甲醛和0.2%戊二醛的PBS（pH 7.4）固定细胞10分钟。用PBS短暂洗涤一次后，再在封闭液（含4%正常山羊血清和0.04% Triton X-100的PBS）中孵育15分钟。需注意，FM1-43FX对本步骤及后续步骤中使用的Triton X-100用量非常敏感。通常情况下，不使用任何Triton X-100时FM1-43FX标记效果最佳，但为便于后续免疫染色所需的细胞通透，仍需使用少量去垢剂。我们通过经验确定，0.04% Triton X-100最适用于前突触沉默突触的检测。
- 将vGluT-1一抗用封闭液按1:2500比例稀释。将细胞置于稀释后的一抗溶液中，在室温下轻轻振荡或旋转孵育3小时。务必用铝箔覆盖培养皿，防止FM1-43FX染料被漂白。
- 用PBS洗涤细胞两次，然后加入与FM1-43FX光谱特性不同的荧光染料偶联的抗豚鼠二抗，以区分两种染色信号。在本实验中，我们使用Alexa 555标记的抗豚鼠抗体，按1:500比例溶于封闭液中。将细胞在室温下振荡孵育30分钟。
- 再用PBS洗涤四次，然后用少量Fluoromount-G将盖玻片封片于载玻片上。确保盖玻片朝向载玻片的一面为细胞所在面。让载玻片在室温下过夜干燥。
- 现在可以开始采集活性与非活性突触的图像。在共聚焦激光扫描显微镜上安装60倍油镜（数值孔径1.4）。将载玻片置于载物台上，确保盖玻片一侧朝向物镜。聚焦后，选择一个神经突密度适中的视野。建议避免在细胞胞体附近成像，因为即使经过充分洗涤，FM1-43FX染料仍可能在该区域残留。在本实验中，我们通常将视野放大至51 × 51微米。
- 对选定视野采集深度为7.8微米的z轴层扫图像，共27步，每步0.3微米。该范围足以覆盖本培养体系中神经突的厚度。在每一z轴层面，首先使用激发vGluT-1抗体免疫荧光的激光扫描，以识别显微镜视野中所有谷氨酸能突触。同一视野随后在同一层面重新扫描FM1-43FX荧光信号。在同一次实验的所有盖玻片中，中性密度滤光片和光电倍增管增益应保持一致，并避免信号饱和。我们通常在每个实验条件下采集≥5个视野。
- 使用图像分析软件将z轴层扫数据合成为单平面复合图像。我们采用的最大强度投影法会基于每个像素点在所有层面中的最高强度生成图像。对复合图像进行阈值处理，并独立于FM1-43FX染色识别vGluT-1标记的突触终末用于分析。将染色区域（称为斑点）标记为感兴趣区域。我们通常在每个视野中选择10个斑点。随后对FM1-43FX通道进行阈值处理，并叠加感兴趣区域。利用分析软件量化每个信号的荧光强度及每个斑点的面积。可通过绝对像素标准或百分比像素标准区分活性与非活性突触。
代表性结果
- 在我们的培养物中，发现70-80%的谷氨酸能突触（通过vGluT-1染色定义）表现出可检测到的FM1-43染色2, 6-8。在绿色FM1-43荧光与红色vGluT-1染色的叠加图像中，这表现为大量黄色斑点：即标志物共定位的突触。这些由箭头指示。
- 约20-30%的（红色）vGluT-1阳性斑点不会显示出高于基线水平的（绿色）FM1-43荧光。这些为无活性的突触前终末，示例由箭头指示。
- 还可观察到第三类突触群体。这类突触显示（绿色）FM1-43荧光阳性，但缺乏（红色）vGluT-1染色。这些为活跃的GABA能突触，示例由星号标记。这些突触在我们的大多数分析中被排除，但可通过使用囊泡GABA转运蛋白抗体替代vGluT-1抗体进行专门研究。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
意义
- 通常认为，突触通过以可测量的概率释放递质来发挥作用。我们及其他研究者的工作表明，尽管某些突触具备完整的囊泡神经递质转运蛋白和其他关键的突触前标志物，但仍对神经递质的释放呈不应状态2, 6-8。我们先前已证明，神经元中的基础网络活动对于维持这类非活性突触群体至关重要。
关键步骤
- 使用 500 μM Advasep-7 进行短暂洗涤可显著提高 FM1-43FX 染色的质量。然而，该洗涤步骤的时间即使略微超过 5 秒，也会导致 FM1-43FX 标记的丢失。
- FM1-43FX 对免疫染色步骤中所用 Triton X-100 的用量非常敏感。在完全不使用 Triton X-100 的情况下，FM1-43FX 标记效果最佳；但为了实现细胞通透以进行 vGluT-1 免疫染色，仍需使用一定量的去污剂。我们通过实验确定，0.4% Triton X-100 是检测突触前沉默突触的最佳浓度。
修改
-
...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 DA018109 和 MH78823，以及 NIH 神经科学蓝图核心资助项目 P30NS057105（资助对象：华盛顿大学）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| FM1-43FX | Invitrogen | F-35355 | 红移的 FM4-64FX 也可获得，但其在突触前沉默检测中的适用性较差。 |
| Advasep-7 | CyDex | AR-0A7-001 | |
| vGluT-1 | EMD Millipore | AB5905 | |
| Alexa 647 标记的抗 GP 抗体 | Invitrogen | A-21450 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
参考文献
- Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
- Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Olney, J. W., Mennerick, S. Physiological activity depresses synaptic function through an effect on vesicle priming. J. Neurosci. 26, 6618-6626 (2006).
- Moulder, K. L., Jiang, X., Chang, C., Taylor, A. A., Benz, A. M., Conti, A. C., Muglia, L. J., Mennerick, S. A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing. J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).
- Sara, Y., Mozhayeva, M. G., Liu, X., Kavalali, E. T. Fast vesicle recycling supports neurotransmission during sustained stimulation at hippocampal synapses. J. Neurosci. 22, 1608-1617 (2002).
- Kay, A. R., Alfonso, A., Alford, S., Cline, H. T., Holgado, A. M., Sakmann, B., Snitsarev, V. A., Stricker, T. P., Takahashi, M., Wu, L. G. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 809-817 (1999).
- Rosenmund, C., Sigler, A., Augustin, I., Reim, K., Brose, N., Rhee, J. S. Differential control of vesicle priming and short-term plasticity by Munc13 isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
- Altrock, W. D., tom Dieck, S., Sokolov, M., Meyer, A. C., Sigler, A., Brakebusch, C., Fassler, R., Richter, K., Boeckers, T. M., Potschka, H., Brandt, C., Loscher, W., Grimberg, D., Dresbach, T., Hempelmann, A., Hassan, H., Balschun, D., Frey, J. U., Brandstatter, J. H., Garner, C. C., Rosenmund, C., Gundelfinger, E. D. Functional inactivation of a fraction of excitatory synapses in mice deficient for the active zone protein bassoon. Neuron. 37, 787-800 (2003).
- Ting, J. T., Kelley, B. G., Lambert, T. J., Cook, D. G., Sullivan, J. M. Amyloid precursor protein overexpression depresses excitatory transmission through both presynaptic and postsynaptic mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 353-348 (2007).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
