利用单分子DNA拉伸实验直接观察酶复制DNA

摘要

我们描述了一种通过噬菌体复制系统蛋白介导，对单个DNA分子进行实时复制观察的方法。

摘要

我们描述了一种通过噬菌体复制系统蛋白介导，实时观察单个DNA分子复制过程的方法。将线性化的λ DNA进行修饰，使其一条链的一端带有生物素，同一链的另一端连接地高辛分子。生物素化的一端与经功能化的玻璃盖玻片结合，地高辛化的一端则连接微小小球。将这些DNA-小球连接物组装在流动池表面，可施加层流以对小球产生拖拽力。由此产生的力使DNA几乎平行于盖玻片表面并被拉伸，其受力大小由流速决定（图1）。通过监测小球的位置来测量DNA的长度。利用单链与双链DNA之间的长度差异，可实时获取复制叉处复制蛋白活性的信息。通过测定小球位置的变化，可精确确定DNA解旋和聚合的速率及持续性（图2）。

方案

1. DNA 复制模板

反应所用的DNA是经过线性化的λ DNA，通过将寡核苷酸退火形成复制叉结构而修饰得到。此外，生物素连接在λ DNA一条链的一端，而地高辛配基则连接在同一链的另一端¹。

材料： 噬菌体λ DNA，寡核苷酸：生物素标记的叉臂（A：5'-生物素-AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGATCTAGCATCAATCACAGGGTCAGGTTCGTTATTGTCCAACTTGCTGTCC-3'），λ互补叉臂（B：5'-GGGCGGCGACCTGGACAGCAAGTTG GACAATCTCGTTCTATCACTAATTCACTAATGCAGGGAGGATTTCAGATATGGCA-3'），叉臂引物（C：5'-TGCCATATCTGAAATCCTCCCTGC-3'），λ互补地高辛标记末端（D：5'-AGGTCG CCGCCCAAAAAAAAAAAA-地高辛-3'），T4 DNA连接酶，T4多核苷酸激酶，加热金属块。

1. 使用T4多核苷酸激酶对寡核苷酸B和D的5'端进行磷酸化。
2. 将寡核苷酸A、B和C以一步法退火至λ DNA：在T4 DNA连接酶缓冲液中，加入过量10倍的寡核苷酸A和B，以及过量100倍的寡核苷酸C。
3. 将混合物置于加热块中加热至65 °C。加热完成后关闭加热块，使其缓慢冷却，以确保寡核苷酸正确退火。
4. 向混合物中加入T4 DNA连接酶，在室温下孵育2小时。T4 DNA连接酶将催化寡核苷酸A与B以及λ DNA之间的正确连接。
5. 最后，在T4 DNA连接酶缓冲液中，加入相对于λ DNA过量100倍的寡核苷酸D，使寡核苷酸D退火至DNA复制模板上。
6. 将混合物在加热块中于45 °C孵育30分钟，随后关闭加热块，使其缓慢冷却至室温。
7. 最终的DNA复制模板现已制备完成，可供使用。我们将模板以1.4 nM的浓度保存于4 °C，可稳定数周。

2. 磁珠

珠子经修饰后带有针对地高辛的Fab片段，随后可将其连接至DNA复制模板²。

材料：Tosyl 活化微珠、抗地高辛 Fab 片段、缓冲液 A：0.1 M H3BO3 pH 9.5、缓冲液 B：0.1 M PBS pH 7.4，0.1% w/v BSA、缓冲液 C：0.2 M Tris-HCl pH 8.5（25 °C），0.1% w/v BSA、磁力分离器、旋转仪。

1. 重悬磁珠的储备液，并取少量分装至离心管中。将离心管放入磁力架的插槽中，孵育至溶液澄清，然后用移液器吸去上清液。
2. 加入缓冲液A，以活化甲苯磺酰基团用于抗体偶联。用移液器轻轻混匀后，使用磁力架去除缓冲液。
3. 加入Fab片段，再次用缓冲液A重悬磁珠，充分混匀后，在37 °C下旋转孵育16–24小时。孵育结束后，使用磁力架分离磁珠并去除缓冲液。
4. 加入缓冲液B进行洗涤，于4 °C孵育5分钟，然后使用磁力架去除缓冲液。重复洗涤两次。
5. 加入缓冲液C，在37 °C孵育4小时，以封闭未反应的甲苯磺酰基团。使用磁力架分离磁珠并去除缓冲液。
6. 用缓冲液B洗涤两次后分装使用。磁珠可在4 °C保存1年或更长时间而不会显著降低质量（我们的储备液浓度为1–2×10⁹ 个磁珠/mL）。

3. 功能化盖玻片

为了使DNA能够附着在玻璃盖玻片上，首先用氨基硅烷对玻璃进行功能化处理，然后将其与生物素化的PEG分子偶联。这种涂层有助于减少DNA和复制蛋白与表面的非特异性相互作用^3,4。

材料： 玻璃盖玻片、染色缸、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、甲氧基-PEG5k-NHS酯、生物素-PEG5k-NHS酯、丙酮、1 M KOH、乙醇、烘箱、水浴超声仪

1. 将玻璃盖玻片放入染色缸中，并用乙醇充满染色缸，彻底清洗盖玻片。超声处理30分钟，倒出乙醇并用1 M KOH充满染色缸。重复上述清洗步骤两次。
2. 进行第一次功能化反应前，必须去除所有残留水分。用丙酮充满染色缸，超声处理10分钟，倒空后再次用丙酮充满。
3. 在丙酮中配制体积分数为2%的硅烷试剂溶液。将该溶液加入染色缸中，振荡反应2分钟。此反应使氨基硅烷的烷氧基与玻璃表面结合，留下可用于下一步偶联反应的活性氨基。用大量水终止反应。
4. 将盖玻片置于110 °C烘箱中烘烤30分钟，使其干燥。
5. 在100 mM NaHCO₃（pH 8.2）溶液中配制甲氧基与生物素化PEG比例为50:1的混合液，目标浓度约为0.2 % w/v的生物素化PEG。
6. 用移液器吸取100 μL PEG混合液滴加到干燥的硅烷化盖玻片上，再将另一片盖玻片覆盖其上。使用玻璃盖玻片作为间隔物可便于后续分离两片盖玻片。
7. 将盖玻片在PEG溶液中孵育3小时，然后分开每对盖玻片，并用大量水充分洗涤。操作时需小心保持盖玻片的功能化面朝上，因为仅有一侧被PEG包被。
8. 用空气吹干盖玻片，并在干燥器中真空保存。表面功能化效果至少可稳定保存一个月，因此可一次性制备数十片盖玻片，按需使用。

4. 流动腔室的制备

实验使用一个简单的流动腔进行，该流动腔由经过功能化的盖玻片、双面胶带、石英载片和管路构成。每次单分子实验需准备一个流动腔^2,4。

材料：双面胶带、剃刀刀片、带管孔的石英载玻片、快干环氧树脂、功能化盖玻片、链霉亲和素溶液（25 μL，1 mg/mL，溶于PBS中）、管路、封闭缓冲液（5X：20 mM Tris pH 7.5，2 mM EDTA，50 mM NaCl，0.2 mg/mL BSA，0.005% Tween-20）、工作缓冲液（1X：20 mM Tris-HCl pH 7.5，2 mM EDTA，50 mM NaCl）。

1. 首先将 5 mL 封闭缓冲液和 20 mL 工作缓冲液混合，并置于真空干燥器中，以去除后续步骤中可能存在的气泡。
2. 取一片 PEG 功能化的盖玻片，将 125 µL 用 PBS 稀释的链霉亲和素溶液均匀涂布于表面。在室温下孵育 20 分钟，同时准备流动池的其他部分，使链霉亲和素与表面的生物素结合。
3. 裁剪一块与石英载玻片尺寸相匹配的双面胶带。在胶带上标记出管路孔的位置，以便绘制出流动室的轮廓。
4. 在胶带上制作一个 3 mm 宽的中央通道，并包含两个孔的矩形区域。我们使用的流动室具有两个入口和两个出口的 Y 形通道。
5. 沿所绘制的轮廓线进行切割，确保切口平直、整齐，避免胶粘剂突入通道内。
6. 使用丙酮或乙醇彻底清洗石英载玻片，以去除之前构建流动池时残留的胶黏物。
7. 找到胶带通道轮廓的最佳对齐位置，撕去一侧的背衬保护膜，小心地将胶带贴附到石英载玻片上。注意对齐准确，确保入口和出口孔不被堵塞。
8. 为流动池的入口和出口裁剪适当长度的管路。将管路末端以约 30° 角斜切，有助于防止管路末端紧贴流动室底部。将管路放置在适当支撑物（例如管架）上，使其悬空，便于下一步连接到流动池。
9. 用去离子水彻底冲洗已包被链霉亲和素的盖玻片，并用压缩空气吹干。请注意仅一侧具有功能化修饰。撕去胶带另一侧的背衬保护膜，将石英载玻片贴合到盖玻片上。
10. 轻轻按压盖玻片，以挤出粘合界面中可能夹带的空气。这有助于防止气泡进入流动通道。
11. 用环氧树脂密封流动室的四周。将已裁剪的管路插入石英片上的孔中，并用环氧树脂固定。此步骤需静置数分钟使其干燥。
12. 待环氧树脂干燥后，开始进行表面封闭：通过其中一根管路抽吸脱气后的封闭缓冲液。21 号针头可完美插入 0.76 mm 的管路中。反复冲洗数次以排除气泡，然后让流动室至少孵育半小时。

5. 单分子复制实验

在DNA模板和功能化微珠制备完成且流动池准备就绪后，即可进行单分子实验。

材料：制备好的流动腔室、封闭缓冲液（5X：20 mM Tris-HCl pH 7.5，2 mM EDTA，50 mM NaCl，1 mg/mL BSA，0.025% Tween-20）、工作缓冲液（1X：20 mM Tris-HCl pH 7.5，2 mM EDTA，50 mM NaCl）、含或不含10 mM MgCl₂的T7复制缓冲液（1X：40 mM Tris-HCl pH 7.5，50 mM K-谷氨酸盐，2 mM EDTA，100 μg/mL BSA，10 mM DTT，600 μM dNTPs）、复制蛋白、配备10X物镜的倒置光学显微镜、CCD相机、永久性稀土磁铁、注射泵、空气弹簧、光纤照明器、装有图像采集软件的计算机。

1. 封闭流动池后，即可开始实验。
2. 取流动池并将其放置在显微镜载物台上，用载物台夹固定腔室，并确保流动通道与CCD相机对齐。
3. 使用较大直径的连接管或针头将流动池的出口管连接至气弹簧。气弹簧用于稳定任何流动不规则性。取一个50 ml塑料管，加入45 ml水，管盖用环氧树脂密封。在盖子上穿刺三个孔，插入三段管路，并用环氧树脂将管路与盖子密封，防止空气进入或逸出。将气弹簧连接至注射泵以及流动池的出口管。
4. 将流动池的入口管置于封闭缓冲液中，回抽注射器以去除管路中的空气。轻轻弹击出口管有助于清除流动池中滞留的气泡。
5. 待所有气泡完全清除后，用针头封闭其中一个入口管，通过将其中一个出口管弯折180°并用胶带固定来封闭该管路。
6. 将DNA模板储备液用脱气的封闭缓冲液稀释至10 pM，总体积为1 ml。以中等流速将溶液注入腔室，以实现良好的DNA表面覆盖率（0.01–0.05 ml/min，持续20分钟效果良好）。可根据每批盖玻片表面的DNA分子数量或实验所需密度适当调整该步骤。
7. 将磁珠储备液用脱气的封闭缓冲液稀释至2–4×10⁶ 个磁珠/ml，总体积为1 ml。以0.01–0.05 ml/min的流速注入腔室，持续15分钟。
8. 磁珠加入后，停止流动，使腔室达到平衡状态，然后关闭两个出口管路。若未关闭腔室而对管路进行任何操作，将引起压力波动，从而对磁珠施加强剪切力，导致DNA分子断裂。
9. 用针头封闭用于加载磁珠的入口管，使用第二个入口管以脱气的1X封闭缓冲液（溶于工作缓冲液）开始清洗流动池。以0.01–0.05 ml/min的流速充分清洗，并通过轻敲载物台手动震荡，以去除非特异性吸附在表面的磁珠（轻敲）。
10. 待游离磁珠充分去除后，停止流动，使腔室达到平衡。关闭开放的出口管，将入口储液瓶切换至蛋白溶液，并缓慢打开出口管，以避免压力骤变。
11. 可通过改变流动方向来检查磁珠是否与DNA连接（DNA）。
12. 现在可进行酶促反应。对于前导链合成实验，将gp4解旋酶配制成20 nM溶液，将gp5聚合酶（以与其持续合成因子硫氧还蛋白形成的复合物形式纯化）配制成20 nM溶液，溶剂为不含MgCl₂的脱气T7复制缓冲液。
13. 以中等流速将蛋白溶液注入腔室，以促进蛋白与DNA的有效结合。我们通常采用0.037 ml/min流速持续8分钟，随后以0.012 ml/min流速持续7分钟。
14. 使用不含MgCl₂的脱气T7复制缓冲液清洗腔室，以去除未结合的游离蛋白。0.037 ml/min流速清洗3–10分钟即可达到良好效果。
15. 清洗后，注入含MgCl₂的T7复制缓冲液，并开始数据采集。采用0.012 ml/min的流速，该条件下DNA连接的磁珠所受拖拽力约为3 pN。
16. 成像前，在流动池上方放置一块稀土永磁体，以防止磁珠与表面之间的非特异性相互作用。
17. 使用10X物镜和CCD相机观察视野，并利用一个连接的磁珠进行调焦。
18. 将光纤照明器置于靠近显微镜的位置，入射角介于10度至与显微镜载物台平行之间。采用暗场照明以增强磁珠成像的对比度。
19. 以较低帧率（通常为2–4 Hz）持续采集20–30分钟的数据。

6. 代表性结果

在一个成功的实验中，你应该能够同时观察到超过100个微珠（前导链合成）。该实验应产生大量显示前导链DNA合成的轨迹数据。

数据分析：

为了测量DNA解旋和聚合的速率及持续性，必须精确确定微珠的位置。可通过将这些位置与二维高斯函数进行拟合来实现。随后，可使用追踪软件（例如DiaTrack）逐帧追踪微珠位置，从而提取轨迹。接下来，可利用任意绘图软件（例如Origin）绘制微珠位置随时间变化的曲线，以可视化轨迹。为获得速率数据，需对曲线进行线性回归拟合并计算斜率。对于持续性，则需确定从缩短事件开始到结束时DNA的总长度（图3）。这两个数值均需转换为碱基对。将微珠移动距离转换为碱基对时，首先需要测量在反应流速下拉伸的λ DNA分子的长度。由于λ DNA的长度已知（48,502 bp），可在实验力条件下校准每个像素对应的碱基对数目。为提高准确性，应从目标轨迹中减去未发生酶促变化的微珠连接链的基线轨迹。汇总所有单次测量结果，并绘制速率和持续性的分布图。分别使用高斯函数和单指数函数对数据进行拟合（图3）。

图 1. 单分子实验装置示意图。（a）双链 λ DNA（48.5 kb）通过其中一条链的 5' 端利用生物素-链霉亲和素相互作用固定在流动池表面，同一条链的 3' 端则通过地高辛-抗地高辛相互作用连接至微球。在远离微球的一端形成一个已启动的复制叉，以便聚合酶的加载。（b）利用缓冲液的层流拉伸微球-DNA 组装体，并通过宽场光学显微镜成像。通过在保持恒定拉伸力的同时追踪微球位置随时间的变化，可实时监测 DNA 构建物的长度。（c）低拉力条件下单链 DNA（实心圆）与双链 DNA（空心圆）的伸长曲线。虚线表示完全双链 λ DNA 的晶体学长度，为 16.3 μm。在约 3 pN 的拉力下，单链 DNA 与双链 DNA 的长度存在显著差异，因此可通过监测 DNA 长度的变化直接观察单链与双链之间的转换。同时可视化大量与 DNA 偶联的微球，使得在一次实验中可研究多个独立的复制体。

图2. 噬菌体T7复制蛋白：在脱氧核糖核苷酸和镁离子存在下，DNA聚合酶（gp5与硫氧还蛋白的复合物）和DNA解旋酶（gp4）共同合成DNA前导链。该过程伴随滞后链因缠绕而缩短。双链DNA转化为单链DNA导致微珠位置发生变化。通过测量微珠位置可精确定量DNA复制的速率和持续性。

图3. 单分子前导链合成实验中典型数据的示例。DNA复制的持续性等于一次缩短事件从开始到结束的DNA总长度。DNA复制速率通过线性回归拟合曲线并计算斜率获得。插图显示了通过整合多次测量数据得到的复制速率和持续性的分布情况。数据分别采用高斯函数和单指数函数进行拟合。

讨论

必须确保层流对珠子施加的拖拽力不会影响复制蛋白的酶活性。例如，对应于0.012 ml/min流速的3 pN力不会影响DNA前导链的复制。然而，该力会影响协调DNA合成过程中发生的酶活性，因此必须将其降低至1.5 pN。通过调节流速或流动通道的宽度即可轻松控制拖拽力⁵。

DNA拉伸实验利用双链DNA与单链DNA之间的长度差异。在本实验中，双链DNA向单链DNA的转化是由于前导链的合成所致（图2）。需要注意的是，只有在低于6 pN的低拉伸力条件下，单链DNA才比双链DNA更短（图1）。

该方法的一种可能改进是通过在复制模板的滞后链3'端连接第二个微珠来对其进行修饰。这种改变将能够直接观察发生在DNA两条链上的酶活性。

除了用于研究前导链合成和协调复制外，DNA拉伸实验还已成功用于检测λ外切核酸酶的单分子动力学，以及复制过程中聚合酶交换的动力学^5,6。原则上，该方法可用于研究任何DNA加工酶。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
噬菌体 λ DNA	新英格兰生物实验室	N3011L
DNA 寡核苷酸	Integrated DNA Technologies
T4 DNA 连接酶	新英格兰生物实验室	M0202L
T4 多核苷酸激酶	新英格兰生物实验室	M0201L
α-地高辛 Fab 抗体片段	罗氏集团	11214667001
甲苯磺酰活化磁珠	英杰生命技术公司	142-03
磁力分离器	英杰生命技术公司	Dynal MPC
3-氨基丙基三乙氧基硅烷	Sigma-Aldrich	A3648	可使用其他氨基硅烷，或与非氨基反应性硅烷混合以获得更稀疏的表面
琥珀酰亚胺基丙酸酯 PEG	Nektar		类似 PEG 产品可从 Nanocs、CreativePEGWorks 等公司购买
生物素-PEG-NHS	Nektar		类似 PEG 产品可从 Nanocs、CreativePEGWorks 等公司购买
双面胶带	Grace Bio-Lab 公司	SA-S-1L	厚度为 100 μm
石英载玻片	Technical Glass	20 mm (宽) × 50 mm (长) × 1 mm (高)	尺寸需适配盖玻片。使用金刚石钻头（DiamondBurs.net）钻孔
聚乙烯管	BD 生物科学公司	427416	内径 0.76 mm，外径 1.22 mm 可使用其他尺寸的管路替代
链霉亲和素	Sigma-Aldrich	S4762	配制成 1 mg/mL 溶液，以 PBS（pH 7.3）分装为 25 μL 每份
脱氧核糖核苷三磷酸混合溶液	新英格兰生物实验室	N0447
配备 10X 物镜的倒置光学显微镜	奥林巴斯公司	Olympus IX-51
永久性稀土磁铁	国家进口公司	www.rare-earth-magnets.com
CCD 相机	QImaging	Rolera-XR Fast 139
注射泵	哈佛仪器公司	11 Plus	以灌注模式运行，便于更换溶液
光纤照明器	Thorlabs 公司	OSL1