使用单分子DNA拉伸含量直接观察DNA复制的酶

Summary

我们描述了一个观察单个DNA分子介导的蛋白质的噬菌体复制系统的实时复制的方法。

Abstract

我们描述了一个观察单个DNA分子介导的蛋白质的噬菌体复制系统的实时复制的方法。线性λDNA被修改，有一个链上的生物素，地高辛基团上的同一条电缆的另一端。生物素标记的一端连接到一个官能的玻璃盖玻片和digoxigeninated结束的小珠。一个流细胞表面上这些DNA珠系绳大会允许应用层流珠施加的阻力。因此，被拉伸的DNA靠近和平行的流量（图1）确定力在盖玻片表面。测量长度的DNA监测珠的位置。单双链DNA之间的长度差异，利用获得的实时信息，在交岔路口的复制蛋白的活性。测量珠的位置可以精确测定平仓DNA和聚合（图2）的速率和processivities。

Protocol

1。 DNA复制模板

DNA的反应是一个线性的λDNA寡核苷酸退火形成一个复制叉的修改。此外，生物素连接的λDNA链的结束，一个地高辛基团连接到同^一条 1的另一端。

材料:λ噬菌体的DNA，寡核苷酸:生物素化的叉臂（答:5' -生物素- AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGATCTAGCATCAATCACAGGGTCAGGTTCGTTATTGTCCAACTTGCTGTCC - 3'），λ互补叉臂（B:5' - GGGCGGCGACCTGGACAGCAAGTTG GACAATCTCGTTCTATCACTAATTCACTAATGCAGGGAGGATTTCAGATATGGCA - 3'），叉底漆（C:5' TGCCATATCTGAAATCCTCCCTGC - 3'），λ互补的地高辛结束（D:5' - AGGTCG CCGCCCAAAAAAAAAAAA地高辛- 3'），T4 DNA连接酶，T4多聚核苷酸激酶，热块。

1. 磷酸寡核苷酸的B和D的5'末端用T4多聚核苷酸激酶。
2. 退火寡核苷酸在一个步骤中，A，B和C的λDNA加入一个寡核苷酸A和B超过10倍，和一个超过100倍，在T4 DNA连接酶缓冲液的寡核苷酸彗星。
3. 加热至65 ° C在加热块的混合物。加热后，打开热封锁，并允许缓慢冷却到适当的退火寡核....

Discussion

重要的是要确保对珠层流曳力不影响酶活性的复制蛋白。举例来说，一个3 PN的力量，对应到0.012毫升/分钟的流速不影响复制的DNA领先链。但它的影响，采取协调DNA合成过程中酶的活性，因此将减少到1.5 PN。拖曳力可以很容易地控制，通过改变流速或流^道 5的宽度。

DNA拉伸实验采用双和单链DNA之间的长度差异。在实验中所描述这里的单链DNA双链DNA转换作为一个领先的链的合成（图2）的结果发生。你应该记住的单链DNA双链较短，仅低于6 PN低拉伸力（图1）。

这种方法的一个可能的改进是修改第二珠附着其3' -末端的复制模板的滞后链。这种交替将允许直接观察酶的活性，在DNA双链。

除了 ​​领先的链合成的研究和协调复制，DNA拉伸实验已经成功地采用了审查^期间复制5,6λ核酸外切酶的单分子反应动力学和动态聚合酶交流。原则上，这种方法可以用来研究任何DNA加工酶。

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
噬菌体 λDNA	New England Biolabs	N3011L
DNA 寡核苷酸	整合 DNA 技术
T4 DNA 连接酶	New England Biolabs	M0202L
T4 多核苷酸激酶	New England Biolabs	M0201L
α-地高辛 Fab	罗氏集团	11214667001
甲苯磺酰活化珠	Invitrogen	142-03
磁性分离器	Invitrogen	Dynal MPC
3-氨基丙基-三乙氧基硅烷	Sigma-Aldrich	A3648	其他氨基硅烷可用于非胺反应性硅烷或与非胺反应性硅烷混合，以获得更稀疏的表面
琥珀酰亚胺酯	PEG Nektar		类似的 PEG 可从 Nanocs、CreativePEGWorks 等处购买。
生物素-PEG-NHS	Nektar		类似的 PEG 可以从 Nanocs、CreativePEGWorks 等处购买。
双面胶带	Grace Bio-Lab Inc.	SA-S-1L	100 μm 厚度
石英载玻片	技术玻璃	20 毫米 （宽）x 50 毫米 （长）x 1 毫米 （高）	尺寸适合盖玻片。用金刚石钻头钻孔 （DiamondBurs.net）
聚乙烯管	BD Biosciences 427416		0.76 mm 内径，1.22 OD 可以替代其他尺寸的管。
链霉亲和素	Sigma-Aldrich	S4762	制备 1 mg/mL 溶液，25 μ在 PBS pH 7.3
脱氧核糖核苷酸三磷酸溶液混合物	New England Biolabs	N0447
带 10 倍物镜的倒置光学显微镜	林巴斯公司	Olympus IX-51
Permament 稀土磁铁	国家进口	www.rare-earth-magnets.com
CCD 相机	QImaging	Rolera-XR Fast 139
注射泵	Harvard Apparatus	11 Plus	以补充模式运行，以便于更换溶液
Fiber Illuminator	Thorlabs Inc.	OSL1