用于蛋白质组学研究的Fusarium spp.培养物毒素诱导与蛋白质提取

摘要

为了符合蛋白质组学实验最低信息标准（MIAPE）指南，对真菌物种进行蛋白质组学分析所需的蛋白质提取必须实现高度标准化。我们提供了一个视频方案，其中包含在毒素诱导及从Fusarium spp.中提取蛋白质过程中减少实验偏差的操作步骤。

摘要

Fusaria 是能够产生多种毒素的丝状真菌。镰刀菌霉菌毒素，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol）、雪腐镰刀菌烯醇（nivalenol）、T2毒素、玉米赤霉烯酮（zearelenone）、镰刀菌酸（fusaric acid）、单端孢霉烯（moniliformin）等，对人类和动物健康具有不良影响，其中一些还被认为是致病因子。蛋白质组学研究已被证明在解析Fusaria毒素产生机制（Taylor et al., 2008）以及鉴定潜在致病因子（Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007）方面行之有效。因此，建立可靠的方法以实现不同蛋白质组学研究之间的比较变得至关重要，从而确保实验、菌株及实验室之间所观察到的蛋白质表达差异是真实存在的。本文所描述的实验流程将从两个方面促进蛋白质组学操作的标准化水平提升。视频化操作协议可用于精确描述更详尽的操作细节；此外，采用标准化流程处理生物学重复样本，有助于提高数据的稳健性，同时也能将人为因素对提取步骤技术可重复性的影响纳入考量。

本方案完成需要16天：其中14天用于培养，2天用于蛋白质提取（图1）。

简而言之，Fusarium 菌株在固体培养基上培养 4 天后，经人工剪碎并转移至改良的产毒诱导培养基（Jiao et al., 2008）中继续培养 10 天。菌丝体通过 Miracloth 滤布过滤收集。研磨操作在低温室中进行。为消除技术操作差异带来的偏差，由不同操作人员独立完成提取重复实验（n=3）（图 2）。蛋白提取基于 Taylor 等（2008）所述的 SDS/DTT 缓冲液方法，并进行了轻微修改。总蛋白提取需使用丙酮/TCA/DTT 缓冲液在 4°C 过夜沉淀蛋白，并用丙酮/DTT 溶液洗涤（图 3a, 3b）。最终将蛋白重新溶解于蛋白标记缓冲液中并进行定量。提取结果通过一维凝胶电泳（图 4，SDS-PAGE）进行可视化检测，随后进行二维凝胶电泳（IEF/SDS-PAGE）。该方法同样适用于其他培养基及其他丝状真菌的蛋白质组学分析（Miles et al., 2007）。

方案

完成该方案需要16天。时间安排详见图1。

缓冲液配制的详细步骤

• 裂解缓冲液的配制（每份样品3 mL）。
• 洗涤缓冲液的配制（每份样品50 mL）。该缓冲液应预先冷却，并在-20°C冰箱中保存至后续分析使用，整个操作过程中需置于冰上。
• 沉淀缓冲液的配制（每份样品20 mL）。该缓冲液应预先冷却，并在-20°C冰箱中保存至使用前，整个操作过程中需置于冰上。
• 实验操作最好在4°C的冷室中进行。

真菌物种

用于蛋白质组学分析的三个菌株根据其形态特征和翻译延伸因子α-1分析（O'Donnell 等，1998）被归类为Fusarium graminearum

这些菌株属于CRP-Gabriel Lippmann保藏 collection，保存于含15%甘油的-80°C环境中。

菌丝体的制备

真菌在V8培养基上于25°C条件下培养4天，光照与黑暗周期各12小时交替进行。使用无菌刀片将菌丝体切割成碎片，并取这些碎片接种于含有100 mL产毒诱导培养基的250 mL锥形瓶中。培养10天后收集菌丝体，通过无菌滤膜过滤将菌丝体与培养基分离。用无菌水洗涤菌丝体3次，以去除残留的培养基成分及其他化合物。随后立即加入液氮速冻细胞，并将样品保存于-80°C条件下。

蛋白质提取的总体描述

采用图3A和3B中所述方法提取蛋白质样品。Fusarium样品在液氮中研磨后，将粉末收集至10 ml聚四氟乙烯（Teflon）管中。样品随后与裂解缓冲液在室温下孵育30分钟，煮沸10分钟，再于室温下离心两次（12000g，每次15分钟）。收集上清液，加入沉淀缓冲液于-20 °C孵育过夜。在4°C、30000g条件下离心45分钟后，收集沉淀的蛋白沉淀物，并用含DTT的冷丙酮洗涤3次。最后，将沉淀物空气干燥，并用标记缓冲液重新溶解蛋白，调节pH至8.0。取30 ml分样用于总蛋白定量，其余上清液于-20°C保存，直至进行蛋白质电泳。

图 1. 实验流程时间线。

图 2. 多操作员样本处理流程示意图。

图 3a。

图 3b。 请点击此处查看图 3a 的放大版本，或点击此处查看图 3b 的放大版本。

图3a-b。 蛋白质提取流程图（A：第一天；B：第二天）。

图4. 蛋白质提取物的一维图谱。蛋白质电泳至蓝色染料迁移至凝胶末端为止，凝胶使用Lava Purple染色。请点击此处查看图4的放大版本。

讨论

近年来，蛋白质组学方法在真菌生物学领域的应用日益受到关注，使用该技术的研究发表数量显著增加（参见 Kim et al., 2007 年的综述）。蛋白质提取方法依赖于多种提取步骤的组合，但这些方法在实验方法部分通常描述得较为简略，且需要研究者具备处理潜在问题的技术经验。

与其他“组学”研究方法一样，建立样本和数据处理的标准对于生成可靠的科学信息至关重要。此外，必须充分描述样本及操作流程，以便在不同“组学”实验之间实现结果的共享解读。这对于充分挖掘基因组学、蛋白质组学、代谢组学等跨数据挖掘的潜力至关重要（Morrison et al., 2006）。目前已起草了关于蛋白质组学实验的最低信息要求，并成立了多个工作组，以解决实验中的各个方面问题（凝胶电泳、质谱分析、分子相互作用、蛋白质修饰、蛋白质组学信息学、样本处理）。然而，目前尚无针对样本处理流程的明确定义信息。鉴于蛋白质提取步骤对蛋白质组学研究最终质量具有重要影响，为了在MIAPE指南框架内推进标准化操作（Taylor et al., 2007），我们提出采用视频协议详细展示样本处理过程。实验的视频描述可显著增加样本处理相关信息的透明度，从而提高“组学”实验的可重复性（Pasquali, 2007）。

事实上，实验室之间的可重复性是确保蛋白质组学结果有效性的基本要求（http://www.fixingproteomics.org）。跨实验室的可重复性受两个因素影响：不同的仪器设备以及不同操作人员对样本的处理。

在本方案中，我们建议进行涉及多名操作人员的生物学重复实验（图2和视频），以提高数据的可靠性（即考虑了结果的技术变异）。

所述蛋白质提取方法基于SDS和加热处理。此前已证明该方法可保证获得较高纯度和产量的蛋白质（Bridge 1996）。SDS与煮沸结合可溶解细胞壁、疏水性蛋白质，并防止形成导致蛋白质沉淀中止的寡聚体。煮沸还可使蛋白酶失活。EDTA、PMSF和完全迷你蛋白酶抑制剂也能产生相同的抑制效果。DTT可断裂蛋白质内部及蛋白质之间的二硫键，从而促进蛋白质的溶解。

为了在等电聚焦（IEF）前去除SDS，需使用丙酮/三氯乙酸（TCA）/二硫苏糖醇（DTT）对蛋白质进行沉淀。此外，当存在脂质、核酸、盐类和/或酚类化合物时，丙酮/TCA/DTT沉淀还可去除这些部分污染物。与SDS类似，这些分子会阻碍IEF过程中的良好迁移。在完成该沉淀步骤后，必须使用丙酮/DTT洗涤沉淀的蛋白质，以去除可能干扰IEF的TCA。

良好的样品制备是获得理想结果的关键。为此，还必须避免环境中的蛋白质污染，操作时应佩戴无粉手套，并严格遵守良好的实验室规范。从技术角度来看，在本方案所述的流程中，获得足量且高纯度蛋白质的最关键步骤有两个阶段：首先是研磨阶段，彻底破坏细胞对于释放蛋白质至关重要；其次是总蛋白质的纯化阶段，该阶段需去除大部分脂质、DNA及其他可能干扰蛋白质迁移的污染物。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养基与溶液 马铃薯葡萄糖琼脂：39 g 马铃薯葡萄糖琼脂（Difco）；1 L 蒸馏水。 V8 琼脂：200 ml V8（金宝汤）’s，美国）、2 g CaCO3（Sigma）、16 g 琼脂（DIFCO）、800 ml 蒸馏水 产毒诱导培养基：1克 K2HPO4，0.5 g KCl，0.5 g MgSO₄4 7H2O、10 mg FeEDTA、2 g L-谷氨酸、10 g蔗糖溶于1 L蒸馏水中。 裂解缓冲液: <表格 边框="1">
	100 mL	终浓度
Tris-HCl pH8	5 mL	50 mM	1 M
十二烷基硫酸钠	2克或10毫升	2%	20%
DTT	500 mL	10 mM	2M
EDTA	20 mL	0.1 mM	0.5 M
PMSF	200 mL
完全型迷你蛋白酶抑制剂	1片
水	Qsp

沉淀缓冲液:

<表格 边框="1"> 100 mL 终浓度 三氯乙酸 20 mL 20% DTT 0.1 mL 0.1% 丙酮 Qsp

洗涤缓冲液：

<表格 边框="1"> 100 mL 终浓度 DTT 0.1 mL 0.1% 丙酮 100 mL

标记缓冲液（于 -18°C 保存）°C，分装成小份：

<表格 边框="1"> 1 mL 终浓度 尿素 140 mg 7M 硫脲 50 mg 2M CHAPS 40 mg 4% Tris 30 μL 30 mM 水 1 mL