我们介绍了一种基于氧依赖性磷光淬灭效应来测量脑血管中氧分压（pO2）的实验方法。本文概述了用于大视野CCD成像测量大鼠脑内pO2以及基于双光子激发成像测量小鼠脑内pO2的动物准备和成像操作流程。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
监测脑部血液和组织氧合的时空特征对于深入理解神经-代谢-血管之间的关系至关重要。开发新型的pO2测量方法，实现对更大视野范围内pO2的同步监测，并具备更高的空间和/或时间分辨率，将有助于更深入地揭示正常脑功能的机制，同时也将对中风、阿尔茨海默病和脑损伤等神经血管疾病的诊断与治疗产生重要影响。
光学成像技术已展现出巨大潜力，能够基于血红蛋白在可见光及近红外光谱范围内的吸收特性，实现对组织氧分压（pO2）的高时空分辨率和定量成像。然而，脑血氧饱和度的多光谱测量依赖于光子在高度散射的脑组织中的迁移过程。为了准确估算血氧水平，通常需要对组织光学参数进行估计和建模，而这些参数在实验过程中可能发生动态变化。另一方面，基于氧依赖性磷光淬灭效应来测定氧分压（pO2）的方法，受组织光学参数变化的影响较小，并可提供pO2的绝对测量值。已有研究表明，利用氧敏感性染料的实验系统可用于灌注组织的活体研究以及组织培养中氧含量的监测，证明磷光淬灭技术是一种能够在生理pO2范围内实现精确氧成像的有效手段。
本文通过两种不同的成像方式，演示如何基于磷光寿命成像技术对皮层血管系统中的氧分压（pO₂）进行测量。在第一个示例中，我们展示了大视野成像技术在大鼠皮层表面进行pO₂成像的应用。该成像方式的实验装置相对简单，主要基于CCD相机和脉冲绿光激光器。我们以Oxyphor R3染料的磷光寿命为例，展示了监测皮层扩散性抑制的过程。在第二个示例中，我们展示了在小鼠皮层微血管系统中进行高分辨率双光子pO₂成像的方法。该实验装置包括一台自行搭建的双光子显微镜，配备飞秒激光器、电光调制器和光子计数型光电倍增管。我们利用一种具有增强双光子激发截面的新型PtP-C343染料，展示了包括毛细血管在内的皮层微血管中pO₂异质性的成像实例。
点击此处查看相关文章 用于生物系统中氧气成像的磷光纳米探针的合成与标定
方案
1. 大鼠皮层血管中 pO₂ 的宽视野成像
- 大鼠（250 g - 350 g）首先用异氟烷麻醉，插管股动脉和股静脉以监测心率、血压和血气，并用于静脉输液。维持体温在 37 ± 0.1 °C。行气管切开术，使用空气与氧气混合气体对大鼠进行通气。
- 每30-45分钟采集一次血样以检测血气，根据结果调整通气和麻醉参数，使血气维持在正常生理范围内。
- 在顶骨上制备一个 4 mm × 4 mm 的封闭颅窗用于成像。去除骨片和硬脑膜后，向颅窗内填充 1.5% 琼脂糖，并用显微镜盖玻片密封。额外留出 1 mm2 在额骨上钻孔，通过皮质内微量注射KCl（约10 μl，1 M）诱导皮质扩散性去极化（CSD）。操作过程中应格外小心，避免损伤皮质血管系统。过度热量、机械压力或短暂缺氧均可能破坏血脑屏障，导致染料从血管渗漏至间质空间。
- 使用光学不透明材料制成的遮罩置于颅窗周围。该遮罩的作用是吸收从硬脑膜边缘渗入周围组织的染料所产生的磷光信号。间质空间中的染料会发出强烈的磷光，可能干扰测量结果。由于间质环境中氧分压较低、淬灭速率较慢，导致染料在此处积聚并发出更强的磷光。因此，若实验中出现明亮的磷光斑点，提示血管结构受损，此类实验数据将被舍弃。
- 手术完成后，停止使用异氟烷，麻醉改为氯醛糖（50 mg/kg 静脉推注，随后以 40 mg/(kg·h) 持续输注）。
- 动物通过带有呼吸机、血压和体....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
我们基于氧依赖性磷光淬灭原理，展示了皮层微血管中氧分压（pO₂）测量的两种应用。第一种基于CCD成像的方法可实现大视野的氧分压监测，而基于双光子显微镜测量皮层微血管中氧分压的方法则具备毛细血管级分辨率，并可实现深层组织成像。两种方法均能实现高速、高信噪比的测量。此外，磷光寿命法测量氧分压在实验过程中对组织光学参数的变化不敏感，而这一点通常是基于强度对比机制的其他光学成像技术所面临的问题。所介绍的仪器可对氧气动态输送及脑组织代谢进行定量分析，有助于更深入理解正常与病变脑组织中的神经血管耦合机制。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
我们感谢美国国立卫生研究院资助项目 R01NS057476、P50NS010828、P01NS055104、R01EB000790、K99NS067050、R01HL081273 和 R01EB007279 以及美国心脏协会资助项目 0855772D 对本研究的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 格隆溴铵 | 试剂 | American Regent Inc. | NDC 0517-4605-25 | 用于控制咽部、气管和支气管分泌物。 |
| 盐酸利多卡因 | 试剂 | Hospira Inc. | NDC 0409-4277-01 | 在手术期间用作局部麻醉剂。 |
| 异氟烷 | 试剂 | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-360-40 | 在手术期间用作全身吸入性麻醉药物，以及在小鼠实验中用作全身麻醉剂。 |
| α-氯醛糖 | 试剂 | Sigma-Aldrich | C0128 | 在大鼠实验中用作全身麻醉剂。 |
| 异硫氰酸荧光素–葡聚糖 | 试剂 | Sigma-Aldrich | FD2000S | 给药后在血液中形成约 500 nM 的浓度。 |
参考文献
- Kleinfeld, D., Friedman, B., Lyden, P. D., Shih, A. Y. Targeted occlusion to surface and deep vessels in neocortex via linear and nonlinear optical absorption, Animal Models of Acute Neurological Injuries. Contemporary Neuroscience Series. Chen, J., Xu, Z., Xu, X., Zhang, J. , Humana Press Inc. (2007).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
