基于氧气依赖性磷光淬灭的大脑血氧测量

摘要

我们介绍了一种基于氧依赖性磷光淬灭效应来测量脑血管中氧分压（pO2）的实验方法。本文概述了用于大视野CCD成像测量大鼠脑内pO2以及基于双光子激发成像测量小鼠脑内pO2的动物准备和成像操作流程。

摘要

监测脑部血液和组织氧合的时空特征对于深入理解神经-代谢-血管之间的关系至关重要。开发新型的pO2测量方法，实现对更大视野范围内pO2的同步监测，并具备更高的空间和/或时间分辨率，将有助于更深入地揭示正常脑功能的机制，同时也将对中风、阿尔茨海默病和脑损伤等神经血管疾病的诊断与治疗产生重要影响。

光学成像技术已展现出巨大潜力，能够基于血红蛋白在可见光及近红外光谱范围内的吸收特性，实现对组织氧分压（pO2）的高时空分辨率和定量成像。然而，脑血氧饱和度的多光谱测量依赖于光子在高度散射的脑组织中的迁移过程。为了准确估算血氧水平，通常需要对组织光学参数进行估计和建模，而这些参数在实验过程中可能发生动态变化。另一方面，基于氧依赖性磷光淬灭效应来测定氧分压（pO2）的方法，受组织光学参数变化的影响较小，并可提供pO2的绝对测量值。已有研究表明，利用氧敏感性染料的实验系统可用于灌注组织的活体研究以及组织培养中氧含量的监测，证明磷光淬灭技术是一种能够在生理pO2范围内实现精确氧成像的有效手段。

本文通过两种不同的成像方式，演示如何基于磷光寿命成像技术对皮层血管系统中的氧分压（pO₂）进行测量。在第一个示例中，我们展示了大视野成像技术在大鼠皮层表面进行pO₂成像的应用。该成像方式的实验装置相对简单，主要基于CCD相机和脉冲绿光激光器。我们以Oxyphor R3染料的磷光寿命为例，展示了监测皮层扩散性抑制的过程。在第二个示例中，我们展示了在小鼠皮层微血管系统中进行高分辨率双光子pO₂成像的方法。该实验装置包括一台自行搭建的双光子显微镜，配备飞秒激光器、电光调制器和光子计数型光电倍增管。我们利用一种具有增强双光子激发截面的新型PtP-C343染料，展示了包括毛细血管在内的皮层微血管中pO₂异质性的成像实例。

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方案

1. 大鼠皮层血管中 pO₂ 的宽视野成像

1. 大鼠（250 g - 350 g）首先用异氟烷麻醉，插管股动脉和股静脉以监测心率、血压和血气，并用于静脉输液。维持体温在 37 ± 0.1 °C。行气管切开术，使用空气与氧气混合气体对大鼠进行通气。
2. 每30-45分钟采集一次血样以检测血气，根据结果调整通气和麻醉参数，使血气维持在正常生理范围内。
3. 在顶骨上制备一个 4 mm × 4 mm 的封闭颅窗用于成像。去除骨片和硬脑膜后，向颅窗内填充 1.5% 琼脂糖，并用显微镜盖玻片密封。额外留出 1 mm² 在额骨上钻孔，通过皮质内微量注射KCl（约10 μl，1 M）诱导皮质扩散性去极化（CSD）。操作过程中应格外小心，避免损伤皮质血管系统。过度热量、机械压力或短暂缺氧均可能破坏血脑屏障，导致染料从血管渗漏至间质空间。
4. 使用光学不透明材料制成的遮罩置于颅窗周围。该遮罩的作用是吸收从硬脑膜边缘渗入周围组织的染料所产生的磷光信号。间质空间中的染料会发出强烈的磷光，可能干扰测量结果。由于间质环境中氧分压较低、淬灭速率较慢，导致染料在此处积聚并发出更强的磷光。因此，若实验中出现明亮的磷光斑点，提示血管结构受损，此类实验数据将被舍弃。
5. 手术完成后，停止使用异氟烷，麻醉改为氯醛糖（50 mg/kg 静脉推注，随后以 40 mg/(kg·h) 持续输注）。
6. 动物通过带有呼吸机、血压和体温监测仪的推车进行转移。在呼吸室内空气的情况下，迅速将动物移至成像装置，并重新连接至流量计，通入适当比例的空气与氧气混合气体。
7. 将固定动物的立体定位仪置于物镜下方。颅窗应位于物镜视野中央，并调整至与焦平面平行。
8. 打开脉冲激光器并将其设置为最小脉冲能量。将光束导向脉冲能量计，并调节输送至样品的脉冲能量，使其不超过 10 mJ/cm²光束以约60度的倾斜入射角对准颅窗中心，激光处于关闭状态。
9. 在动物的所有生理参数均达到正常生理范围之前，持续进行血气测量，并调整通气和麻醉。
10. 假设血容量约为体重的7%，将适量磷光探针Oxyphor R3溶解于1 mL生理盐水中，以达到4 x 10^-5 通过股静脉注射探针溶液，测定探针的血液浓度。
11. 配制1 M氯化钾溶液，并用注射器通过额骨上的钻孔注入约1 μl，以诱导皮层扩布性抑制（CSD）。
12. 打开激光器，并在注入KCl溶液后立即开始成像。磷光成像持续约10分钟。
13. 再次进行血气检测，以确认动物生理参数仍在正常范围内。
14. 所有像素的磷光寿命通过在 Matlab 中使用带统计权重的非线性最小二乘法拟合单指数衰减获得。磷光寿命通过经验性的类似 Stern-Volmer 关系（见下文）转换为 pO₂ 值。

2. 小鼠皮层微血管中高分辨率双光子pO2成像

1. 小鼠使用异氟烷麻醉，经股动脉插管以监测心率、血压和血气，并用于染料注射。维持小鼠体温在37 ± 0.1 °C，动物自主呼吸空气与氧气的混合气体。
2. 根据David Kleinfeld和Winfried Denk最初开发的技术制备颅窗。操作过程中需格外注意避免损伤血管系统，以防止染料渗漏至间质空间。
3. 在整个制备过程以及通气和麻醉期间，采集少量血液样本用于检测血气，并根据结果调整通气和麻醉参数，以维持血气在正常生理范围内。
4. 将动物转移至成像装置。使用改良的立体定位架固定动物，并将其置于物镜下方。在 Olympus 4X 物镜下，将颅窗置于视野中央，并调整使其与焦平面平行。
5. 通过目镜使用数码相机拍摄颅窗图像，然后将4倍物镜更换为奥林巴斯20倍物镜（NA = 0.95）。
6. 在动物的所有生理参数均达到正常生理范围之前，持续进行血气测量，并调整通气和麻醉。
7. 假设血容量约为体重的7%，将适量磷光探针PtP-C343溶解于0.2 mL生理盐水中，使探针在血液中的浓度约为15 μM。通过股动脉注射探针溶液。
8. 实验开始时，为每个像素设定染料激发和发射信号采集的预期时间间隔。
9. 获取一张慢速二维荧光强度衰减的扫描图像，该图像可显示当前深度下的血管结构。将物镜沿颅窗垂直方向（Z轴）移动，使用840 nm波长的最低激光功率进行慢速二维荧光强度扫描，以确定成像平面内的微血管位置。
10. 在每个成像深度，根据该深度的磷光扫描结果，选择血管内的一组点，并对每个点的磷光衰减信号进行预设次数的重复采集以实现平均化。
11. 设置所需的平均次数、测量间隔和实验持续时间，然后开始测量。pO₂ 在实验持续期间，按照指定的测量时间间隔，在选定位置获取测量数据。
12. 测量过程中，软件通过调节振镜扫描镜的位置，将激发激光重定向至选定的位置。对振镜扫描器、电光调制器及所有其他设备的控制均由基于LabView开发的自定义软件完成。
13. 使用Matlab中的非线性最小二乘法拟合单指数衰减曲线，获得所有选定位置的磷光寿命。通过经验性的类似斯特恩-沃尔默（Stern-Volmer）关系式（见下文），将磷光寿命转换为pO₂值。
14. 在获取不同皮层深度的数据后，向血管系统注射葡聚糖偶联荧光素染料，以成像微血管结构。
15. 使用四通道探测器中的绿色通道，通过双光子成像采集FITC荧光信号，获得血管结构图像的三维堆栈。
16. 动物实验严格按照麻省总医院研究动物护理小组制定的指南和规定进行。

3. 代表性结果：

图1. 该图左侧的图（a）显示了CSD波到达前组织内氧分压的宽视野图像。右侧的图（b）显示了在图（a）中标记的兴趣区域内，CSD传播过程中平均氧分压随时间的变化情况。

图2（avi动画）： 该动画显示了在CSD波传播过程中，整个颅窗内氧分压的时间演变过程。比例尺表示氧分压，单位为毫米汞柱。

图 3. 成像血管结构堆栈的三维投影。灰色阴影表示基于结构图像生成的容积血管掩模。 测得的 pO₂ 值以颜色编码。比例尺为 200 微米。经自然出版集团许可转载。⁷

讨论

我们基于氧依赖性磷光淬灭原理，展示了皮层微血管中氧分压（pO₂）测量的两种应用。第一种基于CCD成像的方法可实现大视野的氧分压监测，而基于双光子显微镜测量皮层微血管中氧分压的方法则具备毛细血管级分辨率，并可实现深层组织成像。两种方法均能实现高速、高信噪比的测量。此外，磷光寿命法测量氧分压在实验过程中对组织光学参数的变化不敏感，而这一点通常是基于强度对比机制的其他光学成像技术所面临的问题。所介绍的仪器可对氧气动态输送及脑组织代谢进行定量分析，有助于更深入理解正常与病变脑组织中的神经血管耦合机制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
格隆溴铵	试剂	American Regent Inc.	NDC 0517-4605-25	用于控制咽部、气管和支气管分泌物。
盐酸利多卡因	试剂	Hospira Inc.	NDC 0409-4277-01	在手术期间用作局部麻醉剂。
异氟烷	试剂	Baxter Internationl Inc.	NDC 10019-360-40	在手术期间用作全身吸入性麻醉药物，以及在小鼠实验中用作全身麻醉剂。
α-氯醛糖	试剂	Sigma-Aldrich	C0128	在大鼠实验中用作全身麻醉剂。
异硫氰酸荧光素–葡聚糖	试剂	Sigma-Aldrich	FD2000S	给药后在血液中形成约 500 nM 的浓度。