Drosophila 血细胞在发育中的胚胎表面广泛分布。本实验方案展示了如何对血细胞带有荧光标记的胚胎进行装片和成像，以观察这些迁移过程。
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摘要
摘要
许多研究利用体外方法，而生理学上相关的环境应为生物体自身内部的环境。本文介绍一种用于样本固定的方案Drosophila melanogaster 胚胎以及对该生物体的荧光标记血细胞（即胚胎巨噬细胞）进行后续的活体成像。利用Gal4-UAS系统1我们驱动多种遗传编码的、荧光标记的报告分子在血细胞中表达，以追踪其在胚胎发育过程中的分布与迁移。在收集到目标发育阶段的胚胎后，去除胚胎外部的绒毛膜，然后将胚胎置于卤代烃油中，夹在一层疏水性、透气的膜与盖玻片之间，用于活体成像。除了可分析迁移的整体参数（如速度和方向性）外，结合F-actin和微管的荧光报告分子进行高分辨率成像，还可进一步揭示这些细胞骨架组分的动态行为。
方案
制备
- 获取适当的 果蝇 含有血细胞特异性 Gal4 驱动子的品系（例如 srp-Gal42）以及在UAS控制下的遗传编码荧光报告基因（例如 uas-GFP）。对于纯合的果蝇 srp-Gal4,uas-GMA3 或 crq-Gal4,uas-GFP4, 5 对于成像目的特别有用（注：GMA 是 GFP 与 moesin 蛋白肌动蛋白结合域的融合蛋白）；有关可使用的 Gal4 驱动子和 UAS 构建体范围的讨论见下文（Bloomington Stock Centre 提供了多种选择）。
- 通常通过荧光标记的平衡染色体来平衡突变等位基因，从而进行遗传杂交 CTG 或 TTG6，使用位于不同同源染色体上的Gal4驱动子和uas构建体。这使得能够根据荧光标记的缺失来筛选纯合突变体 CTG/TTG-相关的GFP荧光（此步骤在阶段2.11进行）。
- 扩增果蝇品系，并将果蝇放入含有苹果汁琼脂平板的产卵笼中7果蝇需要至少两天时间适应产卵笼，才能开始产下足够数量的胚胎。通常每种性别各二十只果蝇足以产生用于成像的胚胎，但需注意不同品系的生育力存在差异。我们使用可放入塑料烧杯底部的55 mm培养皿，并在培养皿底部打孔以允许空气流通。胚胎收集的具体方法并不重要，但收集时间至关重要，以确保获得正确发育时期的胚胎。
- 从置于过夜的苹果汁琼脂平板上收集胚胎 25°C 或从定时产卵板中获取。对于后者，我们通常让果蝇在预热的培养板上产卵4小时，然后移走培养板并置于 18°C 在胚胎固定前15-16小时进行处理；此方法可获得从发育晚期12阶段至15阶段的胚胎。过夜培养的样本虽包含更广泛的发育阶段，但由于血细胞中荧光报告基因表达时间更长，因而具有更高的荧光强度优势 25°C 因为Gal4-UAS系统对温度敏感。
实验步骤
- 使用少量水和软头画笔从苹果汁琼脂平板上分离胚胎。脱离的胚胎可用肉眼轻松观察。
- 将胚胎转移至细胞筛网（Fisher）或自制的转移篮7 通过将苹果汁琼脂平板中的水倒入置于烧杯上方的篮子中，以收集废水。
- 重复步骤 2.2，直至确认已从苹果汁琼脂平板转移了足够数量的胚胎。
- 使用水在细胞滤网/篮中清洗胚胎。
- 将细胞滤网/篮置于苹果汁琼脂平板的培养皿盖中，并加入足量未稀释的次氯酸钠溶液，使胚胎悬浮于细胞滤网/篮中。
- 在体视显微镜下明场观察胚胎去壳过程：当背侧附属结构溶解时，表明去壳完成，此过程应在两分钟内完成。
- 将装有胚胎的细胞滤网/篮子从次氯酸钠溶液中取出，用水冲洗掉残留的次氯酸钠。在进入步骤2.8之前，应彻底去除所有次氯酸钠残留。判断是否完全去除残留次氯酸钠的一个方法是：用蓝色实验室擦纸吸去残留水分——如果存在残留次氯酸钠，蓝色会褪为白色或粉红色。
- 用实验室纸巾或MediWipes擦拭细胞过滤器/篮的底部，吸去残留水分。
- 在培养皿盖内滴加一滴水。用细毛刷将去壳胚胎篮中的所有去壳胚胎收集起来，并重悬于水滴中。随后使用移液枪吸除水分，或用实验室纸巾/医用擦拭巾小心吸干，以干燥胚胎。
- 胚胎干燥后，加入一滴Voltalef油以完全覆盖所有胚胎。在含有胚胎的油滴旁再加一滴少量的油。注：我们未能找到英国本地的Voltalef油供应商；可改用Halocarbon oil 700（Sigma）。
- 在荧光解剖显微镜下，使用钟表匠镊子（5号）从油滴中挑选出所需基因型且发育阶段合适的胚胎。镊子尖端应向内弯曲（图1），以便舀取胚胎而不刺破其卵黄膜。将选出的胚胎转移至第二个油滴中。为确保能在共聚焦显微镜下获得良好的图像，必须能够在解剖显微镜下观察到荧光标记的血细胞（图2）。我们通常选择13/14期胚胎用于观察血细胞在腹侧中线的侧向迁移，或选择15期胚胎用于观察血细胞在胚胎表面扩散后的运动行为。
- 将两片盖玻片（18×18 mm，厚度1）用两小滴Voltalef油粘附在Petriperm/Lumox培养皿（Sarstedt）的底部，两者相距约1 cm（图3）；这些盖玻片将用于支撑覆盖在胚胎上方的另一片盖玻片，以避免压碎胚胎。Petriperm培养皿（直径50 mm）含有疏水性、可透气的膜。我们发现，培养皿经过多次使用后会变得更加易于操作（可使用70%乙醇擦拭后重复使用）。
- 在解剖显微镜的明场下，用弯头镊子逐个夹取选定的胚胎，将其腹侧朝上并平行排列于盖玻片边缘（图3）。根据操作者的熟练程度和耐心，最多可排列约15个胚胎。操作胚胎时需动作轻柔，因为胚胎和Petriperm培养皿的膜均较为脆弱，易发生破裂。
- 胚胎排列好后，加入一滴油，使其自然扩散，在两片盖玻片之间形成均匀的油层。待油完全铺展（可能需要数分钟）后，检查胚胎是否仍保持腹面朝上。若胚胎发生轻微翻转，需用镊子再次调整其位置。
- 最后，使用镊子（3号）将一个盖玻片（18×18 mm，厚度1）置于胚胎上方，使其架在先前粘附好的两个盖玻片上。用指甲油将该盖玻片粘附在盖玻片支撑物上（图3）。
- 将装有固定胚胎的Petriperm培养皿送至共聚焦或宽场显微镜处，使用合适的适配器将Petriperm培养皿安装在载物台上。可选用正置或倒置显微镜，物镜通过盖玻片进行聚焦（而非透过膜）。
代表性结果：
本方案描述了如何固定果蝇胚胎，以便对胚胎腹侧的血细胞进行活体成像。若操作得当，可轻松获得血细胞的静态图像或动态影像。成像质量的主要决定因素是用于观察血细胞的显微镜（特别是物镜），但所获得图像的性质还取决于胚胎的发育阶段、胚胎培养温度以及所使用的Gal4和uas品系。
荧光蛋白表达水平越高，越有利于血细胞的成像观察，因此在胚胎处于实验方案第2.11阶段时能够清晰观察到血细胞显得尤为重要（图2展示了在解剖显微镜配备相机拍摄下，胚胎内清晰可见的血细胞示例）。因此，增加Gal4和uas构建体的数量可提高信噪比。此外，这还能降低成像过程中对高激光强度或延长曝光时间的需求，从而能够更长时间地追踪血细胞的行为动态。
GFP 表达水平非常高时，可清晰显示血细胞形态的精细结构，尤其是环绕圆形细胞体的薄片状伪足（图 4A-B）。排除 GFP 的圆形区域代表吞噬体（图 4A-C）。从伪足中还可观察到指状丝状伪足的延伸（图 4B）。使用两个 Gal4 驱动子足以观察这些结构（图 4C），尤其当其中一个或多个为 srp-Gal4 时（见讨论部分），但可能需要降低共聚焦显微镜的扫描速度或提高激光功率。随着表达水平降低，血细胞突起的成像将变得更加困难；尽管如此，在这些条件下仍可追踪血细胞的迁移，因为即使突起不够清晰，细胞体仍然明显可见（图 4D）。
在发育的早期阶段（直至13期），血细胞彼此紧密接触迁移，通常难以区分单个细胞。到13期末，血细胞已在腹侧中线处排列成单列（图5A），随后运动性增强，向腹神经索的边缘横向迁移（图5B）。通过表达GMA（图5C）或cherry-moesin，可直接观察血细胞动态突起中的肌动蛋白细胞骨架。
以这种方式装载胚胎可允许气体交换并防止脱水，从而在成像后仍保持胚胎的活性。如果在装载过程中胚胎受损，通常会很明显，因为胚胎内容物会从其卵黄膜中泄漏出来。如果胚胎开始脱水，则常可通过卵黄膜的变形观察到。在时间序列成像过程中，偶尔会出现胚胎滚动的情况，但这通常仅对长时间尺度的成像造成困扰。最后，同时装载多个胚胎可使实验者最大程度地获得处于理想方向的胚胎，以满足实验需求。
图1. 用于操作去壳胚胎的镊子
钟表工用镊子（5号尺寸）的尖端应向内弯曲，以制成如图所示可舀取胚胎的工具。弯曲部分的外表面在将胚胎放置于Petriperm膜上时也十分有用，因其无锋利边缘，不会刺破胚胎。
图2. 可获得良好活体成像结果的胚胎代表性图像。
在荧光解剖显微镜下拍摄的去绒毛膜胚胎在Voltalef油中的图像（对应方案第2.11阶段）。A为13期srp-Gal4,uas-GFP;crq-Gal4,uas-GFP胚胎的侧视图，B为15期同品系胚胎的侧视图。C为15期srp-Gal4,uas-GFP/+;crq-Gal4,uas-GFP/uas-N17Rac胚胎的侧视图，显示血细胞未能从头部迁移出去，表明当血细胞在其迁移路径上不可见时胚胎的表现。D为17期srp-Gal4,uas-GFP;crq-Gal4,uas-GFP胚胎的侧视图，显示此发育阶段肠道的卷曲结构；由于此时肌肉收缩开始，无法对更晚期的胚胎进行活体成像。E和F分别为13期和14期srp-Gal4,uas-red stinger胚胎的腹侧视图，显示细胞核荧光标记的血细胞已发生弥散。在方案第2.11阶段通过荧光观察到血细胞是获得优质图像的前提；所有图像中，头端朝右。
图3. 在 Petriperm/Lumox 培养皿上固定胚胎。
取两张 18×18 mm 的盖玻片（厚度为1），用少量油滴将其粘附于 Petriperm 培养皿底部，两者间距约 1 cm，如图所示。随后将胚胎腹面朝上排列，使其长轴（前后轴）与盖玻片边缘平行，并在其上覆盖一小滴油。待油扩散并填满两张盖玻片之间的间隙后，将第三张 18×18 mm 的盖玻片（厚度为1）轻轻置于被油覆盖的胚胎上方，利用先前固定的两张盖玻片作为支撑桥，防止胚胎被压碎。随后用两小滴指甲油将该盖玻片粘附于两侧的支撑盖玻片上。待指甲油固化后，即可在正置或倒置显微镜下对胚胎进行成像，物镜通过盖玻片向下聚焦（而非透过 Petriperm 膜进行观察）。
图4. GFP标记血细胞活体成像的代表性结果。
14期srp-Gal4,uas-GFP;crq-Gal4,uas-GFP胚胎腹侧血细胞的Z投影图像（A-B）。（A）为低倍镜图像，可用于延时录像中监测血细胞的发育迁移过程。（B）为腹侧中线血细胞的高倍镜静态图像，显示其形态的精细结构。（C）为14期srp-Gal4,uas-GFP/+;crq-Gal4,uas-GFP/+胚胎腹侧中线血细胞的单层1 µm切片图像，表明即使Gal4驱动子和uas构建体的拷贝数较低，也能获得良好的成像效果。（D）显示14期crq-Gal4,uas-GFP胚胎中血细胞的Z投影图像。此处由于GFP表达水平较低，血细胞的突起结构较不明显，但使用该组合的Gal4驱动子和uas构建体仍可进行录像并追踪血细胞迁移。图像使用Leica LSM510共聚焦显微镜采集；所有图像中头端朝上；图像边缘的环状结构由卵黄膜自发荧光引起。
图 5. 表达 GMA 的血细胞活体成像代表性结果。
来自延时录像的第 13 阶段（A）和第 14 阶段（B）srp-Gal4,uas-GMA 胚胎腹侧中线血细胞的 Z 投影图像，用于展示血细胞的发育迁移过程。通过更高倍数成像可获得关于肌动蛋白动态的详细信息（C）。GMA 由 GFP 与膜褶蛋白（moesin）的肌动蛋白结合域融合而成，可标记肌动蛋白纤维。所有图像中，上方为头端；图像使用共聚焦显微镜采集。
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讨论
该实验步骤中最关键的环节是选择带有清晰标记血细胞的健康胚胎，并在制片过程中小心操作以免损伤胚胎。一旦胚胎置于卤代烃油中，便可抵抗脱水，且制片完成后可连续成像数小时。在我们的实验条件下，使用蔡司LSM510共聚焦显微镜配备40倍物镜，每隔三分钟采集一次z轴层扫图像，可持续成像长达三小时，期间胚胎脱水程度可忽略不计，且无明显光损伤。由于血细胞具有高度动态性，空间分辨率与时间分辨率之间可能存在权衡：若需要获取极高分辨率的图像，血细胞及其内部结构可能在扫描过程中发生移动。后续图像采集的具体参数设置将取决于拟解决的科学问题。
我们通常使用 uas-GFP 或 uas-GMA3 来标记血细胞；其中 uas-GMA 尤为有用，因为它不仅能标记血细胞，还能反映肌动蛋白丝的动态变化。其他 uas 构建体也可用于研究血细胞行为：例如，uas-cherry 构建体9 可作为替代荧光蛋白，或使用 uas-tau-GFP10 来观察血细胞内的微管结构。带有细胞核标记的 ...
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致谢
本方案是在我们与 Paul Martin 和 Antonio Jacinto 实验室开展工作及合作过程中开发完成的。我们感谢布卢明顿果蝇资源中心（Bloomington Stock Centre）提供的优质服务，以及 Drosophila 科研群体持续分享果蝇品系。BS 目前由英国生物技术和生物科学研究所（BBSRC）项目基金资助。WW 由惠康信托基金会（Wellcome Trust）职业发展奖学金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞筛 | BD Biosciences | 352350 | 70μm 孔径 |
| Halcarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Lumox/Petriperm 培养皿 | Sarstedt Ltd | 96077305 |
参考文献
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