活体成像 黑腹果蝇 胚胎血细胞迁移

摘要

Drosophila 血细胞在发育中的胚胎表面广泛分布。本实验方案展示了如何对血细胞带有荧光标记的胚胎进行装片和成像，以观察这些迁移过程。

摘要

许多研究利用体外方法，而生理学上相关的环境应为生物体自身内部的环境。本文介绍一种用于样本固定的方案Drosophila melanogaster 胚胎以及对该生物体的荧光标记血细胞（即胚胎巨噬细胞）进行后续的活体成像。利用Gal4-UAS系统¹我们驱动多种遗传编码的、荧光标记的报告分子在血细胞中表达，以追踪其在胚胎发育过程中的分布与迁移。在收集到目标发育阶段的胚胎后，去除胚胎外部的绒毛膜，然后将胚胎置于卤代烃油中，夹在一层疏水性、透气的膜与盖玻片之间，用于活体成像。除了可分析迁移的整体参数（如速度和方向性）外，结合F-actin和微管的荧光报告分子进行高分辨率成像，还可进一步揭示这些细胞骨架组分的动态行为。

方案

制备

1. 获取适当的 果蝇 含有血细胞特异性 Gal4 驱动子的品系（例如 srp-Gal4²）以及在UAS控制下的遗传编码荧光报告基因（例如 uas-GFP）。对于纯合的果蝇 srp-Gal4,uas-GMA³ 或 crq-Gal4,uas-GFP^{4, 5} 对于成像目的特别有用（注：GMA 是 GFP 与 moesin 蛋白肌动蛋白结合域的融合蛋白）；有关可使用的 Gal4 驱动子和 UAS 构建体范围的讨论见下文（Bloomington Stock Centre 提供了多种选择）。
2. 通常通过荧光标记的平衡染色体来平衡突变等位基因，从而进行遗传杂交 CTG 或 TTG⁶，使用位于不同同源染色体上的Gal4驱动子和uas构建体。这使得能够根据荧光标记的缺失来筛选纯合突变体 CTG/TTG-相关的GFP荧光（此步骤在阶段2.11进行）。
3. 扩增果蝇品系，并将果蝇放入含有苹果汁琼脂平板的产卵笼中⁷果蝇需要至少两天时间适应产卵笼，才能开始产下足够数量的胚胎。通常每种性别各二十只果蝇足以产生用于成像的胚胎，但需注意不同品系的生育力存在差异。我们使用可放入塑料烧杯底部的55 mm培养皿，并在....

讨论

该实验步骤中最关键的环节是选择带有清晰标记血细胞的健康胚胎，并在制片过程中小心操作以免损伤胚胎。一旦胚胎置于卤代烃油中，便可抵抗脱水，且制片完成后可连续成像数小时。在我们的实验条件下，使用蔡司LSM510共聚焦显微镜配备40倍物镜，每隔三分钟采集一次z轴层扫图像，可持续成像长达三小时，期间胚胎脱水程度可忽略不计，且无明显光损伤。由于血细胞具有高度动态性，空间分辨率与时间分辨率之间可能存在权衡：若需要获取极高分辨率的图像，血细胞及其内部结构可能在扫描过程中发生移动。后续图像采集的具体参数设置将取决于拟解决的科学问题。

我们通常使用 uas-GFP 或 uas-GMA³ 来标记血细胞；其中 uas-GMA 尤为有用，因为它不仅能标记血细胞，还能反映肌动蛋白丝的动态变化。其他 uas 构建体也可用于研究血细胞行为：例如，uas-cherry 构建体⁹ 可作为替代荧光蛋白，或使用 uas-tau-GFP¹⁰ 来观察血细胞内的微管结构。带有细胞核标记的 .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞筛	BD Biosciences	352350	70μm 孔径
Halcarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Lumox/Petriperm 培养皿	Sarstedt Ltd	96077305