该技术利用配备HRMAS探头的常规14.1特斯拉波谱仪，实现对活体黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）进行高分辨率魔角旋转质子磁共振波谱（HRMAS 1H-MRS）的分子表征。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
高分辨率魔角旋转（HRMAS）质子磁共振波谱法（1H-MRS）是一种新型的非破坏性技术，可改善谱线宽度，从而能够从提取物、完整细胞、细胞培养物，以及更为重要的完整组织中获得高分辨率谱图，以研究代谢物与细胞过程之间的关系。体内HRMAS1活体果蝇中尚未见报道氢质子磁共振波谱（H-MRS）研究Drosophila melanogaster. Drosophila,作为一种遗传结构较为简单的生物，秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）可在整体生物体水平上研究多种生物学功能及各种在进化上保守的信号通路，是研究遗传学和生理学的有用模型。为此，我们开发并实施了一种in vivoHRMAS1H-MRS 方法用于研究活体Drosophila 在14.1 T下。此处，我们概述了一种HRMAS1H-MRS 分子表征方案Drosophila使用配备有HRMAS探头的传统MR波谱仪。该技术是一种新颖的体内，非破坏性Drosophila一种代谢物检测方法，该方法能够识别疾病生物标志物，从而可能促进新疗法的开发。
方案
第1部分：准备 果蝇 用于HRMAS测量
- 采用标准果蝇实验室操作流程1，收集新羽化的果蝇连续3天，并将其转移至含有新鲜果蝇培养基的果蝇管中。将收集的果蝇培养5天，使果蝇在实验前达到5–8日龄。实验通常仅使用一种性别（一般为雄性）。
- 使用健康、完整的野生型果蝇作为对照，与处理组果蝇（如遭受创伤或基因改造的果蝇）进行比较1。
- 在实验前24小时，将单只果蝇放入含有约0.2 ml果蝇培养基的2 ml离心管中。这些离心管的管盖上需用火焰加热的胰岛素针头打一个小孔。
- 在放入果蝇前后立即使用高精度天平称量离心管重量，并通过后一次重量减去前一次重量来确定每只果蝇的体重。单只雄性果蝇的体重通常为0.7–1 mg。
第2部分：HRMAS 转子 制备。
- 将单个离心管置于冰上，时间少于一分钟，以麻醉管内的果蝇。
- 将果蝇放置在置于冰上的铝箔层上，使用软毛刷轻轻将果蝇推入核磁共振（NMR）转子插件的半球形凹槽内，确保果蝇完全插入，同时避免损伤果蝇。
- 将插件放入氧化锆（ZrO2）转子管（直径4 mm，容积50 μl）中，使果蝇位于转子插件与转子底部之间（见图1）。
- 用螺钉封闭插件，并用石蜡膜（parafilm）覆盖（见图1），以防止果蝇与TSP标准溶液接触（TSP：四氘代三甲基丙酸，trimethylsilyl-propionic-2,2,3,3-d4 acid，分子量 = 172，化学位移δ = 0.00 ppm，50 mM溶于重水-D2O），该溶液作为共振化学位移和定量分析的参考标准）。
- 在转子插件顶部加入8 μl的TSP标准溶液（见图1）。
- 使用顶盖将整个装置固定并拧紧于转子中（见图1）。
第3部分：HRMAS 数据采集
- 将转子装入HRMAS探头中，并将其置于魔角54.7°位置（见图1）。
- 通过BTO-2000单元与MAS气动单元组合将温度设定为4°C。果蝇在谱仪中保持4°C以维持麻醉状态。
- 将HRMAS 1H MRS的转速设置为2 kHz MAS。
- 使用MAS转速控制器（旋转频率）将MAS旋转频率稳定在2.0 ± 0.001 kHz。
- 进行磁体准备：调节并匹配线圈以获得最佳性能，并对磁体进行匀场，以获得最优谱图质量。
- 采用转子同步的Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）自旋回波脉冲序列2 [90°-(τ-180°-τ)n-采集]，获取一维1H谱图，该序列作为T2滤波器，可消除谱线展宽，从而获得所有样品的一维数据。将脉冲间延迟（τ = 500 μs）与MAS旋转频率（2 kHz）同步。设定累加次数为256，数据点数为32,768（32k），采集时间为9分钟。
- 对所有样品采用带有绝热脉冲的TOBSY序列采集二维（2D）1H-1H HRMAS NMR单果蝇谱图3。采集参数如下：直接维2k数据点（谱宽11 ppm），弛豫延迟期间进行1秒水峰预饱和，每个增量扫描8次，共128个增量，总重复时间为2秒，混合时间为45毫秒，总采集时间为29分钟。
第4部分：数据处理/分析
- 使用 MestReC 软件（Mestrelab Research，www.mestrec.com）分析样品的核磁共振谱。
- 对所有 HRMAS 1H FID 数据在傅里叶变换前应用 0.5 Hz 的线宽扩展窗函数。
- 以 TSP 作为外标，将核磁共振谱的化学位移参考至 δ = 0.0 ppm。
- 手动调节谱图相位，并应用 Whittaker 基线估计器，在进行峰面积计算前扣除基线中的宽峰成分。
- 使用 MestReC 软件估算峰面积。以 TSP 为基准对每个采集谱图的峰高进行归一化处理（TSP 峰高 = 1）。采用双尾 t 检验（p<0.05）比较组内与组间比值。
- 二维 TOBSY 处理参数如下：两个维度均采用 QSINE = 2 窗函数，直接维度进行 2k 点傅里叶变换，间接维度零填充至 1k 点，两个维度均进行相位校正，第二维度进行基线校正。
- 使用 Sparky 程序（T. D. Goddard 和 D. G. Kneller，SPARKY 3，USCF，http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/）生成二维谱图。
第5部分：活体样本的代表性光谱 黑腹果蝇 果蝇
上述步骤可实现从活体样本中采集可重复的光谱数据 黑腹果蝇 果蝇。图2和图3显示了在野生型中获得的代表性磁共振波谱（MR spectra）野生型）Oregon-R 果蝇。图 2 展示了 1D 1H HRMAS CPMG 谱。主要脂质成分 [CH3 （0.89 ppm），（CH2)n（1.33 ppm），CH2C-CO（1.58 ppm），CH2C=C（2.02 ppm），CH2C=O（2.24 ppm），CH= CH （5.33 ppm），甘油（1,3-CH 4.10 ppm 和 4.30 ppm；2-CH2 5.24 ppm），以及小分子代谢物：β-丙氨酸（β-Ala，2.57 ppm）、乙酸盐（Ac，1.97 ppm）、磷酸胆碱（PC，3.22 ppm）和磷酸乙醇胺（PE，3.23 ppm），根据先前报道进行了检测与归属4,5。2.02 ppm 处的信号归属于亚甲基质子 C单不饱和脂肪酸（如棕榈油酸）中的H2-CH=CH基团。通过-CH=CH-基团的质子在5.33 ppm处产生的信号鉴定不饱和酸。使用一维谱无法归属或不可见的小分子代谢物，通过二维谱检测。 1H-1H TOBSY HRMAS（见图3）。
图1. 实验装置设置 体内 活体样品的高分辨魔角旋转 1H 磁共振波谱分析 果蝇 在14.1 T下。外标为氘代水中三甲基硅基-2,2,3,3-d4-丙酸（TSP/D2O）。方框中：HRMAS 探头中转子在魔角处的位置。
图2. 体内 活体黑腹果蝇（Drosophila melanogaster wt）的一维高分辨魔角旋转 1H CPMG 谱图。脂质组分：CH3（0.89 ppm）、(CH2)n（1.33 ppm）、CH2C-CO（1.58 ppm）、乙酸盐（Ac）、CH2C=C（2.02 ppm）、CH2C=O（2.24 ppm）、β-丙氨酸（β-Ala）、磷酸胆碱（PC）和磷酸乙醇胺（PE）、甘油（1,3-CH 4.10、4.30 ppm；2-CH2 5.22 ppm）、CH=CH（5.33 ppm）。
图3. 在体 二维 1H-1H 活体TOBSY HRMAS谱 黑腹果蝇 wt 在14.1 T下进行检测。鉴定了小分子代谢物和脂质组分。代谢物：丙氨酸（Ala）、β-丙氨酸（β-Ala）、精氨酸（Arg）、谷氨酰胺（Gln）、谷氨酸（Glu）、磷酸胆碱（PC）、磷酸乙醇胺（PE）、牛磺酸（Tau）、α-葡萄糖（α-Glc）和甘油。脂质组分：CH3 (0.89 ppm)，(CH2)n（1.33 ppm），CH2C-CO（1.58 ppm），CH2C=C（2.02 ppm），CH2C=O（2.24 ppm），CH= CH (5.33 ppm)
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
除最近有关可行性的报告外 体内 果蝇中的磁共振成像 6, 体内 MRS 研究在 果蝇 尚未有报道。在本方案中，我们描述了一种新型方法的实施 体内 高分辨魔角旋转（HRMAS） 1采用氢质子磁共振波谱（H-MRS）方法检测具有重要生物学意义的分子，特别是检测活体中的脂质和小分子代谢物 果蝇 在约45分钟内以14.1 T完成飞行，既实现了零果蝇死亡率，又保证了充足的采集时间。采用转子同步的WURST-8绝热脉冲（C9115在TOBSY中使用）使我们能够获得相对于各向同性混合脉冲（MLEV-16）而言更满意的信噪比和更优的组织谱分辨率，这与先前的报道一致 3, 7. 我们利用TOBSY检测到改善的代谢谱的能力 果蝇 表明将TOBSY与一维CPMG结合使用非常适用于代谢物浓度的同步定性与定量分析，并有助于更准确地评估代谢功能障碍 果蝇
我们的方法提供了可...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
动物实验严格按照麻省总医院机构动物研究审查委员会制定的指南和规定进行。
致谢
本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 AI063433（授予 Laurence G. Rahme）、美国国立卫生研究院（NIH）中心基金项目（P50GM021700）（授予 Ronald G. Tompkins，A. Aria Tzika 为核磁共振核心负责人）以及儿童烧伤医院研究基金（#8893）（授予 A. Aria Tzika）的支持。我们感谢 Dionyssios Mintzopoulos 博士在本实验方案初期开发阶段提供的帮助，以及 Ovidiu C. Andronesi 博士在 TOBSY 脉冲序列方面的协助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 氘代水 | 试剂 | Sigma-Aldrich | 7789-20-0 | |
| 3-(三甲基硅基)丙酸-2,2,3,3-d4 酸 | 试剂 | Sigma-Aldrich | 24493-21-8 | |
| 琼脂，蔗糖，酵母，玉米粉 | 食物 | Genesee Scientific | http://www.flystuff.com/ | |
| Oregon RS 或 Canton-S 果蝇 | 成年果蝇品系 | 布卢明顿品系中心 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ | |
| 画笔 | 仪器设备 | (大小 0) | ||
| 2 ml 管 | 设备 | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| 果蝇培养箱 | 设备 | 高湿度容量（60–75%）、可调温度以及12小时光照：12小时黑暗循环。 | ||
| 布鲁克 Bio-Spin Avance 核磁共振波谱仪（600.13 MHz）4毫米三共振探头（1H, 13C, 2H) HRMAS探头 | 设备 | 布鲁克公司 | ||
| BTO-2000 装置与 MAS 气动装置联用 | 仪器设备 | 布鲁克公司 | ||
| 4毫米氧化锆转子（容量50微升） | 设备 | 布鲁克公司 | B3829（布鲁克商店） | |
| MestReC（Mestrelab Research） | 软件 | 一维核磁共振谱图分析 http://mestrelab.com/ | ||
| SPARKY 3，USCF | 软件 | 二维核磁共振谱分析 http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ |
参考文献
- Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection. Nat Protoc. 4, 1285-1294 (2009).
- Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation time. Rev Sci Instrum. 29, 688-691 (1958).
- Andronesi, O. C., Mintzopoulos, D., Struppe, J., Black, P. M., Tzika, A. A. Solid-state NMR adiabatic TOBSY sequences provide enhanced sensitivity for multidimensional high-resolution magic-angle-spinning 1H MR spectroscopy. J Magn Reson. 193, 251-258 (2008).
- Astrakas, L. G. Proton NMR spectroscopy shows lipids accumulate in skeletal muscle in response to burn trauma-induced apoptosis. Faseb J. 19, 1431-1440 (2005).
- Fan, T. W. M. Metabolite profiling by one- and two dimensional NMR analysis of complex mixtures. Prog Nuc Magn Reson Spec. 28, 161-219 (1996).
- Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. PLoS One. 3, e2817-e2817 (2008).
- Zektzer, A. S. Improved signal to noise in high-resolution magic angle spinning total correlation spectroscopy studies of prostate tissues using rotor-synchronized adiabatic pulses. Magn Reson Med. 53, 41-48 (2005).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
