中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是一种重要的先天免疫机制，可抵御致病性细菌、真菌和寄生虫。本文描述了从人血液中分离中性粒细胞并激活其形成NETs的方法。我们还介绍了在光学显微镜和电子显微镜下观察NETs的制备技术。
本文内容
摘要
摘要
中性粒细胞是外周血中数量最多的白细胞群体。作为专业的吞噬细胞，当中性粒细胞的抗菌颗粒与吞噬体融合后，可将细菌吞噬并在细胞内将其杀灭。我们发现中性粒细胞还具有另一种杀灭微生物的方式：在激活后，它们会释放颗粒蛋白和染色质，二者共同形成可结合病原体的胞外纤维结构。这些新型结构，即中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps, NETs），能够降解毒力因子并杀灭细菌1、真菌2和寄生虫3。NETs的结构骨架是DNA，且在DNase存在时会迅速降解。因此，表达DNase的细菌毒力更强4。通过结合透射电镜（TEM）、扫描电镜（SEM）、免疫荧光和活细胞成像技术的关联显微分析，我们发现，在受到刺激后，中性粒细胞的细胞核失去原有形态，常染色质与异染色质趋于均质化；随后，核膜和颗粒膜破裂，使NET的组分得以混合；最终，随着细胞膜破裂，NETs被释放到胞外。这种细胞死亡程序（NETosis）不同于凋亡和坏死，依赖于NADPH氧化酶产生的活性氧（Reactive Oxygen Species）5。
中性粒细胞胞外诱捕网在急性炎症部位大量存在。NETs 似乎是一种先天免疫反应形式，能够结合微生物，阻止其扩散，并确保局部高浓度的抗菌物质，以降解毒力因子并杀灭病原体，从而使中性粒细胞在其生命周期结束后仍能发挥抗菌功能。然而，越来越多的证据表明，NETs 也参与从自身免疫综合征到不孕症等多种疾病过程6。
我们描述了从人外周血中分离中性粒细胞7并刺激其形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的方法。同时，我们还提供了在光学显微镜和电子显微镜下观察NETs的实验方案。
方案
1. 从人血液中分离中性粒细胞
使用约 24 ml 含 EDTA 或肝素（10 U/ml）作为抗凝剂的人血。
- 在15 ml Falcon离心管中加入6 ml Histopaque 1119，然后小心地将5至7 ml全血覆盖在上层。
- 以800 × g离心20分钟，不启用刹车。
- 吸除并弃去上层淡黄色透明液体，将含有粒细胞的下层红色部分转移至新的Falcon离心管中。
- 用PBS充满Falcon离心管洗涤细胞，并以300 × g离心10分钟。
- 同时，通过将18 ml Percoll与2 ml 10× PBS混合制备100% Percoll溶液。再用1× PBS配制4 ml的85%、80%、75%、70%和65% Percoll溶液。
- 准备两个Falcon离心管，按浓度递减顺序依次叠加每种浓度的Percoll溶液各2 ml，形成Percoll梯度。
- 离心后弃去上清液，合并沉淀物，并将沉淀的细胞重悬于4 ml PBS中。
- 小心地将2 ml重悬液分别铺加到每个梯度上。
- 以800 × g离心20分钟，不启用刹车。
- 离心后去除上层及大部分含PBMC的65%层，收集白色中间界面至85%层之间的部分，转移至新的Falcon离心管中。
- 用PBS充满Falcon离心管洗涤细胞，并以300 × g离心10分钟。
- 弃去上清液，将沉淀的细胞（通常>95%为PMN）重悬于2 ml PBS中。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
2. 激活中性粒细胞
- 在每个孔中放入一个无菌的13 mm圆形玻璃盖玻片（#1,5），以准备24孔细胞培养板。
- 每孔加入500 μl RPMI（含2%人血清白蛋白）并接种2 × 105个细胞，在37°C的CO2培养箱中孵育1小时。
- 同时，在RPMI中配制600 nM PMA溶液，每孔加入100 μl。在37°C的CO2培养箱中孵育15分钟至4小时。
- 用PBS中溶解的4%（终浓度）多聚甲醛固定细胞。
PMA 作为阳性对照，迄今为止是最强效的诱导 NET 形成的试剂。此外，也可使用其他刺激物或与病原体共培养来诱导 NET 形成。
如果制备了额外的平行样本，可以在时间进程进行的同时检测NET形成的相应状态。若将非渗透性DNA染料（如Sytox Green（Invitrogen））加入未固定的细胞中，则仅能检测到细胞外DNA。由于Sytox的存在会在一定程度上影响新NET的形成，因此每个时间点都需要使用一个平行样本进行检测。
3. 通过免疫标记检测NET
中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）即使在固定后也非常脆弱，必须小心操作，否则大多数会在制备过程中丢失。
- 使用弯头针从边缘轻轻挑起附着细胞的玻璃盖玻片，并用精细镊子夹住，将其从24孔培养板中小心取出。将盖玻片细胞面朝下置于一滴PBS上，可在覆盖于试管架上的Parafilm膜上进行。以同样方式用PBS洗涤3次，每次5分钟。
- 将盖玻片置于一滴0.5% Triton X-100中，在室温下孵育1分钟以通透细胞。随后用PBS洗涤3次，每次1分钟。
- 用Parafilm和湿润的纸巾制备一个湿盒。将盖玻片细胞面朝下置于一滴封闭缓冲液（5%驴血清）中，在37°C孵育30分钟。
- 在封闭缓冲液中稀释一抗，例如ms anti Histon和rb anti Neutrophil Elastase。
- 将盖玻片直接从封闭缓冲液转移至湿盒中的一滴一抗溶液上，37°C孵育1小时。
- 用PBS洗涤3次，每次5分钟。
- 在封闭缓冲液中稀释二抗，例如dk anti ms Cy2和dk anti rb Cy3。
- 将盖玻片转移至湿盒中的一滴二抗溶液上，37°C孵育1小时。
- 用PBS洗涤3次，每次5分钟。根据荧光显微镜的配置，可选择使用Hoechst 33342（1 μg/ml，需紫外激发）或Draq5（用于远红激发）对DNA染色5分钟，随后用去离子水洗涤两次。
- 在载玻片上滴加20 μl Mowiol封片剂，将带有细胞的盖玻片细胞面朝下封片。细胞应位于盖玻片与载玻片之间。当盖玻片置于Mowiol液滴上时，会形成一层均匀厚度的薄层。通常无需按压样本。若使用非浸油物镜，样本即可用于观察；若使用浸油物镜进行显微分析，则需让样本干燥约1小时，直至Mowiol在样本边缘固化。
4. 扫描电镜（SEM）样品中中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的制备
- 在24孔板中，用2,5%戊二醛对玻璃盖玻片上的细胞进行固定。
- 从24孔培养板中取出带有细胞的玻璃盖玻片，倒置在水滴上，如此洗涤3次，每次5分钟。
- 将盖玻片转移回含有0,5%四氧化锇的24孔细胞培养板中，孵育30分钟。
- 从24孔培养板中取出带有细胞的玻璃盖玻片，倒置在水滴上，如此洗涤3次，每次5分钟。
- 将盖玻片转移回含有1%单宁酸的24孔细胞培养板中，孵育30分钟。
- 重复步骤4.2至4.4。
- 按以下程序进行脱水（每步5分钟）：
- 30%乙醇
- 50%乙醇
- 70%乙醇
- 80%乙醇
- 90%乙醇
- 100%乙醇
- 100%乙醇
- 100%乙醇
- 将盖玻片转移至临界点干燥器中，对样品进行干燥。
- 使用薄膜蒸发仪在样品表面镀上5 nm的铂/碳层。
5. 代表性结果：
分离方法通常可获得未受刺激的、具有活力的中性粒细胞，纯度超过95%。在刺激后的不同时间点进行固定时，免疫染色方案可显示NETosis过程中形态学变化的序列：细胞变平、核叶消失、颗粒和细胞核完整性丧失，导致细胞核（即组蛋白）与颗粒（即中性粒细胞弹性蛋白酶）染色的重叠逐渐增加。本方案可作为分析病原体与中性粒细胞特异性相互作用的起点。通过扫描电子显微镜制样方案，可对该相互作用进行更详细的解析。
NET 荧光
经刺激的中性粒细胞样本，经NET组分染色（蓝色=DNA，红色=组蛋白，绿色=中性粒细胞弹性蛋白酶）。图像显示了NET的定位，以及DNA和组蛋白的核内定位和中性粒细胞弹性蛋白酶的颗粒样分布模式。
SEM PMA 刺激
扫描电子显微镜图像显示未受刺激和PMA刺激的中性粒细胞。刺激后，中性粒细胞变扁平并产生中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。
SEM NETs 与志贺菌
志贺氏菌被中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）捕获的高分辨率扫描电镜图像。
讨论
所提供的实验方案可用于高纯度分离未经刺激的中性粒细胞，诱导中性粒细胞胞外陷阱（NET）的形成，并分析NETosis过程中的形态学变化。若在处理样本时格外小心，即避免剧烈的洗涤条件（以免导致大部分松散附着的NET丢失），则可比较不同刺激条件下（刺激时间、刺激物）NET的形成量。在此意义上，所提供的实验方案可作为建立更复杂分析方法的起点，例如：中性粒细胞与病原体的相互作用、刺激信号的时序、与其他免疫细胞的协同作用等研究场景。
参考文献
- Brinkmann, V. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 Forthcoming.
- Urban, C. F., Reichard, U., Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms. Cell Microbiol. 8, 668-676 (2006).
- M, E. Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps. PNAS. 106, 6748-6753 (2009).
- Buchanan, J. T., Simpson, A. J., Aziz, R. K., Liu, G. Y., Kristian, S. A., Kotb, M., Feramisco, J., Nizet, V. DNase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps. Curr Biol. 14, 396-400 (2006).
- Fuchs, T. A. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nat Rev Microbiol. 5, 577-582 (2007).
- Aga, E., Katschinski, D. M., van Zandbergen, G., Laufs, H., Hansen, B., Muller, K., Solbach, W., Laskay, T. Inhibition of the spontaneous apoptosis of neutrophil granulocytes by the intracellular parasite Leishmania major. J Immunol. , 169-898 (2002).
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