本方案描述了在活体斑马鱼胚胎中对单个神经元或神经嵴细胞进行成像的方法。该方法利用荧光共聚焦延时显微镜观察细胞行为及肌动蛋白的定位。
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摘要
摘要
斑马鱼是活体成像研究发育过程中细胞行为的理想模型。in vivo条件下，斑马鱼胚胎体外受精，因此在发育的各个阶段均易于获取。此外，其良好的光学通透性使得在完整胚胎的天然环境中对细胞和分子动态进行高分辨率成像成为可能。我们正在采用活体成像方法，分析神经嵴细胞迁移过程中的细胞行为以及神经元轴突的延伸与导向。
活体成像对于理解调控细胞运动过程的机制特别有用。为了观察细胞运动的细节（如突出活动和分子动态），对单个细胞进行标记具有显著优势。在斑马鱼中，质粒DNA注射可产生瞬时的嵌合表达模式，相较于其他细胞标记方法具有独特优点。例如，转基因品系通常会标记整个细胞群体，因而可能掩盖单个细胞中细微突起（或分子分布变化）的观察。此外，在单细胞阶段注射DNA比在后期阶段进行染料注射更具侵入性小且更精确。
本文介绍了一种标记单个发育中的神经元或神经嵴细胞并成像其行为的方法 体内我们将质粒DNA注射到单细胞期胚胎中，从而获得嵌合的转基因表达。这些载体包含细胞特异性启动子，可在部分感觉神经元或神经嵴细胞中驱动目的基因的表达。我们提供了以膜定位的GFP或生物传感器探针标记细胞的示例，后者可用于活细胞中F-actin的可视化观察1.
Erica Andersen、Namrata Asuri 和 Matthew Clay 对本研究工作贡献相同。
方案
1. 注射载玻片和成像载玻片的组装
注射载玻片：
- 根据制造商说明准备Sylgard硅胶弹性体。
- 使用Sylgard将三块标准玻璃显微镜载玻片粘合在一起：将其中一块载玻片叠放在另外两块并排排列（长边相接）的载玻片交叉处上方。上方的载玻片在顶部与底部载玻片之间形成一个直角边或“壁”。
- 让Sylgard过夜固化。这些载玻片可重复使用。
成像玻片：
- 我们使用不锈钢矩形片，其尺寸与标准玻璃显微镜载玻片相同（75 mm × 25 mm × 1 mm），以便使腔室适配显微镜载物台上的载玻片夹持装置。在矩形片中央切割一个直径为1.5 cm的孔。
- 贴附一个22 mm2 用Sylgard将盖玻片固定在金属矩形片上。Sylgard用量应恰好足以完全密封盖玻片。在倒置显微镜下成像时，胚胎将被安置在此盖玻片上，并从底部进行观察。
- 让Sylgard静置过夜。这些载玻片可重复使用，每次使用后用70%乙醇清洗。
2. DNA 重组质粒的制备
为了以组织特异性方式表达外源基因，需将目的基因克隆至细胞特异性启动子下游。我们分别使用斑马鱼neurogenin1基因的cis-调控元件（-3.1ngn1）2或sox10基因的调控元件（-4.9sox10）3，驱动基因在感觉神经元或神经嵴细胞中表达。为了观察细胞及细胞膜动态，我们表达定位于细胞质或细胞膜的荧光蛋白。为了成像F-肌动蛋白的分布，我们表达编码utrophin的calponin同源结构域与mCherry融合的DNA（UtrCH-mCherry）。UtrCH-mCherry生物传感器探针可在不干扰肌动蛋白动态的情况下实现F-actin的可视化1。我们采用Invitrogen Gateway基于重组的克隆策略4，并结合斑马鱼Tol2kit5提供的载体构建上述DNA表达载体。
- 使用多点门控技术（Multisite-Gateway Technology）及斑马鱼Tol2工具包（zebrafish Tol2kit）5中的载体构建表达载体。质粒包含来自pT2KXIGDin的Tol2骨架。
- 使用QIAfilter Plasmid Midi Prep试剂盒（QIAGEN Inc.）纯化质粒DNA，并洗脱于无菌水中。DNA无需线性化即可用于显微注射。
3. DNA 重组质粒的注射
- 将DNA用含0.2%酚红（用于注射过程中的可视化）的水稀释至终浓度为10–50 μg/ml。
- 填充并校准注射针：用拉制的毛细玻璃针吸取约1 μl DNA溶液，并将其插入注射装置的针座中（我们使用Picospritzer）。用精细镊子折断针尖，使针尖开口直径约为10 mm。使用目镜测微尺在矿物油中测量液滴直径。调节压力持续时间，使产生的液滴体积约为1 nl。
- 在E3胚胎培养基（5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4·7H2O，pH 7.0）中收集单细胞期胚胎。
- 将约30–60个胚胎转移至注射载片，使其位于上下载片形成的直角角落中。吸除大部分E3培养基，使胚胎依靠表面张力固定在载片上。
- 使用弯曲的解剖针旋转胚胎，使细胞紧贴注射载片的壁面。
- 使用显微操作器引导注射针穿过胚胎的绒毛膜和卵黄，进入胚胎的单个细胞内，向细胞中注射0.5–1 nl DNA溶液。
- 将注射后的胚胎转移至含有E3培养基的培养皿中，在28.5°C下孵育。如有需要，可通过在较低温度下孵育来减缓胚胎发育速度。
4. 用于成像的胚胎封片
- 在胚胎达到成像所需年龄前约一小时，使用精细镊子去除胚胎的绒毛膜（本实验目的下，受精后约14-17小时）。
- 使用配备荧光装置的解剖显微镜筛选带有标记细胞的胚胎。我们采用尼康AZ100显微镜的4倍物镜（40倍放大），因其兼具长工作距离和高放大倍数。
- 将一个胚胎放入微量离心管中，加入约50 μl含有0.2%三卡因麻醉剂（10倍浓度）的E3溶液。
- 加入500 μl含10 mM HEPES的1%低熔点琼脂糖E3溶液（保持在42°C），使三卡因稀释至终浓度为0.02%。
- 立即使用宽口玻璃移液管将胚胎连同琼脂糖液滴转移至成像载片的盖玻片上。
- 在琼脂糖凝固前，调整胚胎位置，使标记细胞所在区域朝下紧贴盖玻片底部（神经嵴细胞为背侧朝下，脊髓感觉神经元为背外侧朝下）。
- 组装成像室：将塑料环（外径2 cm，高3 mm）一侧涂上硅真空脂，粘附于金属成像载片上；再将另一侧也涂上硅脂。
- 向成像室内加入含10 mM HEPES和0.02%三卡因的E3溶液。将22 mm2盖玻片贴附于环顶部涂有硅脂的表面，密封成像室。
5. 使用 Olympus FV1000 共聚焦显微镜与 IX81 显微镜进行细胞行为的 4D 成像
图像采集的具体细节将取决于显微镜系统的具体配置。本文以 Olympus FV1000 共聚焦显微镜为例，描述其延时成像的采集过程。有关 Zeiss LSM 510 共聚焦系统进行延时成像的详细步骤，请参见此前的 JoVE 实验方案6。
- 将成像腔室放入显微镜载物台上的载物片夹中，使用透射光和10X或20X物镜对胚胎进行聚焦。
- 切换至60X物镜（数值孔径1.2或更高），使用落射荧光对标记的细胞进行聚焦。我们使用油浸物镜（UPLSAPO 60xO，N.A. 1.35）或水浸物镜（UPLSAPO 60xW，N.A. 1.20）。
- 在FV软件（版本1.7c）中，点击XY重复以开始激光扫描。
- 调整采集设置和图像采集控制参数（激光输出、扫描速度、高压、增益和偏移水平），在保持激光功率最低（25%或更低）的同时优化信号，以防止组织损伤并减少光漂白。
- 如需采集Z系列图像，请在Z堆栈中设置上下限以及步长。确保已启用“Depth”图标，以便“XY Sweep”图标中XY和Z均被高亮。点击“XYZ Sweep”图标以开始采集。
- 如需采集延时序列，请在“采集设置”窗口的TimeScan标题下设置时间间隔和时间点数量。点击“图像采集控制窗口”中的Time图标，使“XY Sweep”图标中XY(Z)和T均被高亮。点击“XY(Z)T Sweep”图标以开始采集。
- 或者，可使用TimeController设置延时成像。该程序在生成大型数据集时尤为有用，因其不会超出内存分配。在“Device”下打开TimeController窗口，创建新的成像任务，图像参数窗口将弹出。点击FV Status按钮以更新采集设置。确保在“Terminate”标题下勾选“Save”和“Delete”。设置输出文件名，点击“OK”保存设置并关闭窗口。使用Loop功能设置所需的时间间隔和时间点数量。点击“Ready”和“Start”以开始采集。在成像过程中可使用“Pause”和“Z-shift”功能重新对焦。
6. 代表性结果
图示和视频展示了用膜靶向荧光蛋白或肌动蛋白生物传感器探针标记的感觉神经元和神经嵴细胞的实例。
图1. Tg(ngn1:gfp-caax) 转基因胚胎注射25 pg ngn1:mCherry-caax DNA后的共聚焦图像（z轴投影）。mCherry-CAAX将其中一个神经元标记为红色(A)，背景中所有Rohon-Beard感觉神经元被标记为绿色(B)。C) 绿色和红色通道的合并图像。比例尺 = 50 μm。
图 2. 注射约 20 pg ngn1:mCherry-UtrCH DNA 胚胎中神经元的共聚焦 z 轴投影图像。A) 16.5 hpf 胚胎中的 Rohon-Beard 感觉神经元。F-肌动蛋白信号在生长锥（箭头）以及新形成轴突上的突起中较强。B) 20 hpf 胚胎中的神经元，显示分支的周围轴突生长锥中 F-肌动蛋白信号较强（箭头），而在较成熟的中枢轴突中信号较弱（箭头）。比例尺 = 50 μm。
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讨论
注射DNA的最佳浓度取决于启动子构建体的大小和强度，应通过实验经验确定。注入过多的DNA可能导致胚胎不健康，并出现大量细胞死亡；而注入过少则会导致仅有极小比例的胚胎表达转基因。DNA的表达水平与荧光信号强度相关，且在不同细胞间存在差异。在使用落射荧光进行胚胎分选时，应排除表达水平过高的个体。标记细胞若显得异常明亮，通常还表现出明显的毒性迹象，例如细胞形态异常、标记分子定位错误以及细胞死亡。典型的DNA注射实验中，约有5-10%的胚胎适合用于成像。
当高表达时，F-肌动蛋白生物传感器可能以显性负性方式发挥作用。如果启动子驱动的表达存在问题，可通过注射mRNA实现生物传感器的普遍表达。mRNA注射的优点在于可通过调整mRNA浓度来控制表达水平。通过共注射含有细胞特异性启动子驱动膜定位荧光蛋白表达的DNA构建体，可对这些胚胎中的单个细胞进行标记。我们已采用该方法对神经嵴细胞中的F-肌动蛋白进行成像7。
我们经常在转基因表达品系中进行单细胞标记技术。例如，将 -3.1ngn1:mcherry...
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致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R01 NS042228 项目资助，授予 M.C.H。奥林巴斯 FV1000 共聚焦显微镜通过 NIH 共享仪器资助 S10RR023717 获得，资助对象为威斯康星大学动物学系（PI Bill Bement）。
Erica Andersen、Namrata Asuri 和 Matthew Clay 对本论文贡献相同。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 三卡因（氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐） | Sigma-Aldrich | A5040-250G | |
| Sylgard 硅胶弹性体试剂盒 | Dow Corning | 184 | |
| QIAfilter 质粒中量提取试剂盒 | Qiagen | 12243 | |
| 低熔点琼脂糖 | Invitrogen | 15517-014 | |
| Picospritzer | Parker Hannifin Corporation | 051-0302-900 |
参考文献
- Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
- Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones. Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. 24, (2009).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
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重印与许可
