斑马鱼胚胎中单个神经元和神经嵴细胞的活体成像及肌动蛋白细胞骨架观察

摘要

本方案描述了在活体斑马鱼胚胎中对单个神经元或神经嵴细胞进行成像的方法。该方法利用荧光共聚焦延时显微镜观察细胞行为及肌动蛋白的定位。

摘要

斑马鱼是活体成像研究发育过程中细胞行为的理想模型。in vivo条件下，斑马鱼胚胎体外受精，因此在发育的各个阶段均易于获取。此外，其良好的光学通透性使得在完整胚胎的天然环境中对细胞和分子动态进行高分辨率成像成为可能。我们正在采用活体成像方法，分析神经嵴细胞迁移过程中的细胞行为以及神经元轴突的延伸与导向。

活体成像对于理解调控细胞运动过程的机制特别有用。为了观察细胞运动的细节（如突出活动和分子动态），对单个细胞进行标记具有显著优势。在斑马鱼中，质粒DNA注射可产生瞬时的嵌合表达模式，相较于其他细胞标记方法具有独特优点。例如，转基因品系通常会标记整个细胞群体，因而可能掩盖单个细胞中细微突起（或分子分布变化）的观察。此外，在单细胞阶段注射DNA比在后期阶段进行染料注射更具侵入性小且更精确。

本文介绍了一种标记单个发育中的神经元或神经嵴细胞并成像其行为的方法 体内我们将质粒DNA注射到单细胞期胚胎中，从而获得嵌合的转基因表达。这些载体包含细胞特异性启动子，可在部分感觉神经元或神经嵴细胞中驱动目的基因的表达。我们提供了以膜定位的GFP或生物传感器探针标记细胞的示例，后者可用于活细胞中F-actin的可视化观察¹.

Erica Andersen、Namrata Asuri 和 Matthew Clay 对本研究工作贡献相同。

方案

1. 注射载玻片和成像载玻片的组装

注射载玻片：

1. 根据制造商说明准备Sylgard硅胶弹性体。
2. 使用Sylgard将三块标准玻璃显微镜载玻片粘合在一起：将其中一块载玻片叠放在另外两块并排排列（长边相接）的载玻片交叉处上方。上方的载玻片在顶部与底部载玻片之间形成一个直角边或“壁”。
3. 让Sylgard过夜固化。这些载玻片可重复使用。

成像玻片：

1. 我们使用不锈钢矩形片，其尺寸与标准玻璃显微镜载玻片相同（75 mm × 25 mm × 1 mm），以便使腔室适配显微镜载物台上的载玻片夹持装置。在矩形片中央切割一个直径为1.5 cm的孔。
2. 贴附一个22 mm² 用Sylgard将盖玻片固定在金属矩形片上。Sylgard用量应恰好足以完全密封盖玻片。在倒置显微镜下成像时，胚胎将被安置在此盖玻片上，并从底部进行观察。
3. 让Sylgard静置过夜。这些载玻片可重复使用，每次使用后用70%乙醇清洗。

2. DNA 重组质粒的制备

为了以组织特异性方式表达外源基因，需将目的基因克隆至细胞特异性启动子下游。我们分别使用斑马鱼neurogenin....

讨论

注射DNA的最佳浓度取决于启动子构建体的大小和强度，应通过实验经验确定。注入过多的DNA可能导致胚胎不健康，并出现大量细胞死亡；而注入过少则会导致仅有极小比例的胚胎表达转基因。DNA的表达水平与荧光信号强度相关，且在不同细胞间存在差异。在使用落射荧光进行胚胎分选时，应排除表达水平过高的个体。标记细胞若显得异常明亮，通常还表现出明显的毒性迹象，例如细胞形态异常、标记分子定位错误以及细胞死亡。典型的DNA注射实验中，约有5-10%的胚胎适合用于成像。

当高表达时，F-肌动蛋白生物传感器可能以显性负性方式发挥作用。如果启动子驱动的表达存在问题，可通过注射mRNA实现生物传感器的普遍表达。mRNA注射的优点在于可通过调整mRNA浓度来控制表达水平。通过共注射含有细胞特异性启动子驱动膜定位荧光蛋白表达的DNA构建体，可对这些胚胎中的单个细胞进行标记。我们已采用该方法对神经嵴细胞中的F-肌动蛋白进行成像⁷。

我们经常在转基因表达品系中进行单细胞标记技术。例如，将 -3.1ngn1:mcherry.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
三卡因（氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）	Sigma-Aldrich	A5040-250G
Sylgard 硅胶弹性体试剂盒	Dow Corning	184
QIAfilter 质粒中量提取试剂盒	Qiagen	12243
低熔点琼脂糖	Invitrogen	15517-014
Picospritzer	Parker Hannifin Corporation	051-0302-900