我们报道了一种在植物细胞中引入、追踪和定量分析GFP表达的方法。该方法利用自行设计的机器人系统，对大量样品进行随时间推移的半连续图像采集。我们还展示了使用ImageJ和ImageReady对图像序列进行分析的方法。
本文内容
摘要
摘要
植物组织中的基因表达通常通过从植物组织中破坏性提取化合物来进行研究in vitro分析。本文所述方法利用绿色荧光蛋白（gfp) 基因，以随时间对相同组织样本中的基因表达进行持续监测。gfp基因被置于不同启动子的调控之下，并通过粒子轰击法导入利马豆子叶组织中。随后将子叶放置于一套机器人图像采集系统上，该系统由一台配备数码相机的荧光解剖显微镜和一个二维机器人平台组成，该平台为定制设计，可牢固固定培养皿。每小时对子叶组织进行一次图像采集，持续100小时，以生成各个启动子的表达谱。每组连续采集的100幅图像首先使用ImageReady软件进行手动图像对齐，以确保GFP表达焦点在选定的分析视野中保持一致。随后选取图像序列中大小为300 × 400像素的特定区域，利用ImageJ软件进一步分析，获取GFP强度测量值。将批量图像拆分为红、绿、蓝三个通道，并使用ImageJ的阈值功能识别GFP表达区域。在分别扣除红、绿通道中的背景荧光（即从每个像素中减去非表达区域像素的灰度值）后，通过将每个通道中每个像素的平均灰度值乘以该通道内GFP表达像素的总数，再将红、绿两个通道的计算结果相加，从而得出GFP强度值。对全部100个时间点收集GFP强度值，以获得完整的表达谱。GFP表达谱的差异源于启动子强度、是否存在沉默抑制因子以及启动子性质等因素的不同。除了对GFP强度进行定量分析外，图像序列还被用于使用ImageReady生成延时动画。延时动画显示，绝大多数细胞的GFP表达呈现相对较快的上升，随后缓慢下降。部分细胞偶尔出现荧光突然消失的现象，可能与快速细胞死亡有关。此外还观察到GFP明显跨越膜和细胞壁向邻近细胞运输的现象。延时动画提供了仅通过GFP强度谱或单时间点图像采集无法获得的额外信息。
方案
以下方法概述了使用自动化图像采集系统进行基因表达图像分析的实验方案。为便于说明，整个流程分为四个步骤：1）种子准备，2）利用微粒轰击法导入基因，3）机器人自动采集图像，4）图像分析。尽管该通用方法可广泛应用于其他多种实验场景，但本文所述的具体操作流程基于使用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，gfp）基因，该基因是一种有效的报告基因，可用于长期追踪同一活体组织中基因的表达情况。
一、种子准备
- 可以购买利马豆（Phaseolus lunatus cv. Henderson-Bush）种子，或最好从生长箱中种植的植株上收获（相对湿度50%，光照周期16/8小时 光照：黑暗，昼夜温度25/23°C）。收获后的种子可通过在-20°C下储存以保持种子质量。
- 准备用于种子萌发的Magenta GA7容器。将滤纸或纸巾折叠至适合放入Magenta盒底部。每个容器中加入约25 ml去离子水以润湿纸巾，并倒掉未被吸收的水分。将含湿润纸巾的盒子在高压灭菌器中灭菌20分钟。
- 使用50 ml一次性离心管，在10%市售次氯酸钠溶液中对种子进行消毒（20粒种子置于20–40 ml溶液中），在旋转摇床（60 rpm）上振荡处理20分钟。
注意：后续所有步骤均应在超净工作台内进行。 - 用无菌去离子水冲洗种子4–7次，每次轻轻振荡30秒。
- 将5–6粒无菌种子放置于每个无菌Magenta盒中已折叠好的纸层之间。
- 将种子在以下条件下培养4天：25°C，光照周期16/8小时 光照：黑暗，光照强度40 μEm-2 s-1。
二、利用基因枪轰击法导入基因
- 使用您常用表达载体构建基因载体，载体需携带可在活体组织中检测的报告基因。我们已构建一种高拷贝数表达载体，适用于启动子及启动子元件分析。该载体包含 gfp 基因，用于在转化组织中可视化启动子/启动子元件的功能。
- 在基因枪轰击前约1-2小时，从萌发的幼苗中切下利马豆子叶，并去除种皮。适合轰击的子叶应呈黄色至浅绿色，扁平且无任何可能干扰后续图像分析的损伤。
- 子叶切除后立即置于含MS盐1、B5维生素2、3%蔗糖和0.2% Gelrite（pH 5.7）的OMS培养基上。
- 将DNA载体沉淀到M10钨微粒（Sylvania, Towanda, PA, USA）上。在0.6 ml离心管中加入25 μl钨微粒（使用前用无菌水重悬至100 mg ml-1）、5 μl DNA（1 μg μl-1）、25 μl 2.5 M氯化钙（Sigma-Aldrich 货号 C3881-500G）和10 μl 100 mM亚精胺（Sigma 货号 S-2626）。短暂涡旋振荡，充分混匀所有组分。
- 将DNA混合物冰上孵育5分钟，随后移除并弃去50 μl上清液。
- 通过涡旋振荡重悬DNA包被的微粒，并立即取出2 μl等分试样。每次从管中取样时均需重复涡旋操作。包被微粒应保持在冰上，并在15分钟内使用完毕。
- 通过注射器滤器顶部，将2 μl包被微粒置于滤膜中央。将含有包被微粒的滤器单元放入基因枪腔室内的滤器固定装置中。
- 将一片利马豆子叶腹面朝上放置于挡板上，并将挡板放入基因枪腔室内。该挡板由熔接在烧杯底部的筛网构成，用于在轰击过程中支撑组织。
- 使用基因枪（在本方法中，我们采用实验室设计的一种简单且低成本的粒子流入枪3，PIG）轰击组织，操作如下：a）打开通向真空泵的阀门以抽真空；b）当真空度达到760 mm（30 in）Hg时，启动电磁阀释放氦气以推动微粒；c）轰击完成后，关闭真空管路阀门，并通过排气阀释放真空。用于加速微粒的氦气压力为50 PSI。
- 释放真空后，打开腔室门取出轰击后的子叶，并将子叶腹面朝上放回OMS培养基中。
注意：为进行定量和表达谱分析，我们通常每种DNA载体至少轰击三片子叶。同时设置阳性对照，通常为已知具有明确基因表达模式的DNA载体，作为参照。
III. 自动化图像采集
- 打开汞灯，并等待 30 分钟使灯管预热。
- 打开 Spot-RT CCD 相机（Diagnostic Instruments Inc., Sterling Heights, MI, USA）和机器人平台电机控制器的电源，后者用于驱动机器人平台的运动。
- 在 MZFLIII 体视显微镜（Leica, Heerbrugg, Switzerland）上设置用于 GFP 检测的滤光片组（GFP2 滤光片组；激发光 480/40 nm，发射光 510 LP）。
- 用 70% 乙醇喷洒加厚的聚碳酸酯培养皿盖进行灭菌。这种专用盖子用于覆盖培养皿底部，可在图像采集过程中防止冷凝4。
- 将含有基因枪轰击后子叶的培养皿放置在自动图像采集系统的机器人平台（Arrick Robotics, Hurst, TX, USA）上。该机器人平台由步进电机组驱动，配备可固定 8 个培养皿的载物台，平台由聚碳酸酯、聚丙烯和铝制成。通过拧紧侧向的塑料紧定螺钉将培养皿固定到位。
- 打开控制机器人平台和图像采集的定制软件应用程序，同时打开软件中的白光控制器开关。
- 在“电机运动”选项卡中，点击“电机开启”和“电机归零”。待软件将平台定位至初始位置后，即可开始为每个子叶输入位置坐标。
- 在“电机运动”选项卡中选择第一个培养皿。平台会将培养皿中心定位至显微镜物镜下方。使用移动距离按钮，精确调整第一个子叶的位置以进行图像采集。开启“实时模式”功能后，可通过计算机显示器在白光照明下观察目标区域。
- 对第一个子叶，使用体视显微镜上的手动旋钮设置焦距和放大倍数（推荐使用 1.6 倍放大）。同一培养皿上其余子叶的焦距调整，则通过机器人平台上每个培养皿下方的三个调平螺钉完成。
- 目标区域定位完成后，点击“添加此位置”按钮。软件会将该区域的坐标添加至位置序列文件中，平台将返回培养皿中心位置。
- 使用移动距离按钮和手动调平螺钉，为所有培养皿上的其余子叶设置位置和焦距。待所有子叶的坐标输入完毕后，保存位置序列坐标文件。
- 输入图像采集参数。在“图像设置”选项卡中选择所需光源类型：白光或蓝光。进行 GFP 检测时，仅使用蓝光。同时设置曝光参数。尽管红、蓝、绿三色通道的曝光时间可分别独立调节，但通常在 GFP 图像记录中采用相同设置（红、绿、蓝通道分别为 20、14 和 14 秒），以便对不同 DNA 构建体进行直接且一致的比较。
- 在同一“图像设置”选项卡中，指定一个空文件夹用于存储图像。所有图像序列将按子叶位置输入顺序，在该主文件夹内以编号递增的独立子文件夹形式保存。
- 进入“采集时间控制”选项卡，设置图像采集的时间间隔和总采集周期数。通常每小时采集一次图像，持续 100 小时，以获得清晰的基因表达谱。
- 点击“位置序列”选项卡中的“运行序列！”按钮，开始图像采集。
- 100 小时图像采集结束后，将控制机器人计算机中的所有图像转移至大容量硬盘或计算机中，用于后续图像分析。采集的高分辨率图像（1600 × 1200 像素）以 TIF 格式保存，每个文件大小约为 5 Mb。
IV. 图像分析
- 使用 Adobe ImageReady 将每个文件夹中的 100 张连续图像进行组合。
- 打开 ImageReady 并将构成序列的所有连续图像作为帧导入。
- 将原始图像调整大小为 800 x 600 像素。采集的图像为高分辨率，会产生较大的文件，可能导致图像处理速度变慢。
- 浏览图像，找到在大多数图像中均可见的位置。
- 将选定区域放大至300%。使用更高倍数的放大倍率对图像进行对齐，可实现更精确的配准。
- 在所有图像的上方插入一个图层，并确保其在所有帧中均可见。使用“画笔”工具标记位置。
- 使用“移动”工具并以图层上的标记为参考，开始对齐所有帧。
- 当对齐完成后，删除用作参考的图层，并将图像保存为单个“psd”文件。同时，以最高分辨率将所有帧导出为单个“mov”文件。每组图像的手动对齐耗时约10分钟。
- 使用 ImageJ 进行基因表达量的定量分析。
- 打开 ImageJ 软件，并打开之前在 ImageReady 中保存的 "mov" 文件。
- 使用选择工具，选取一个 400 x 300 像素的区域并裁剪图像。应将此新文件保存为“avi”文件。
- 在 ImageJ 中，点击“图像”、“颜色”和“RGB 分割”，将新“avi”文件中的连续图像分离为红色、蓝色和绿色通道。
- 从绿色和红色通道的所有图像中扣除背景荧光。使用绿色通道图像序列，在非表达细胞区域选择一个20 x 20像素的区域，并在"ROI管理器"工具中记录其位置，以便在两个通道中均选中同一区域。在绿色通道中激活该20 x 20像素方块，前往ImageJ任务栏中的"插件"命令，然后点击"为每个切片扣除已测量ROI"插件工具。
- 在 ImageJ 中，点击“图像”、“调整”，然后点击“阈值”，以定义或分割表达 GFP 的像素。通过拖动阈值窗口中的滑块来调整阈值水平，使平均斑点大小为 20–30 像素。
- 使用我们设计的插件测定GFP表达，该插件可测量每个像素的平均灰度值及GFP表达像素的总数。
- 将ImageJ中的平均输出灰度值复制并粘贴到Microsoft Office Excel中。通过将每个通道（红色和绿色）每像素的平均灰度值乘以该通道中表达GFP的像素总数，计算各通道的GFP表达量。两个通道表达量之和即为总的GFP表达量。这些数值可用于展示基因表达谱并进行直接比较。此外，还可利用“mov”或“avi”文件生成延时动画，直观清晰地呈现基因表达动态变化。
V. 代表性结果
本文报道的机器人图像采集与分析流程（图1）能够在短时间内获取大量关于基因表达的定量数据。在利用gfp基因进行植物启动子表征时，该方法不仅可用于构建瞬时表达谱（图2），还可用于详细追踪瞬时转化和稳定转化植物组织中的GFP表达5,6。利用连续采集的图像生成的短时间间隔动画，是深入分析植物组织中基因表达随时间变化的有力工具。该方法还可广泛应用于评估直接影响基因表达的各种因素。例如，已成功利用我们的自动化图像采集与分析系统，研究了不同病毒来源的基因沉默抑制因子存在条件下GFP的瞬时表达情况7,8。
图1. 图像分析流程包括四个主要步骤。（A）使用机器人图像采集系统获取图像序列，（B）将图像分离为红、蓝、绿三个通道，（C）通过调整阈值水平对表达像素进行分割，（D）获得输出结果，包含灰度值及GFP表达焦点的计数。
图 2. 利用植物启动子驱动 gfp 所产生的不同瞬时表达谱的图表。数据通过我们的机器人图像采集系统收集，并使用 ImageReady 和 ImageJ 软件进行分析。
讨论
机器人技术在人类生活的各个方面具有广泛的应用；具体而言，机器人已成功用于在危险环境中执行任务、自动化繁琐且复杂的操作，以及更精确地完成各项作业。在分子生物学领域，特别是基因表达分析中，机器人不仅能够追踪基因的特征，还能随时间推移监测组织的生长与发育过程。许多生物现象具有动态变化特性，仅通过单个时间点的观察可能难以全面把握。
使用gfp基因进行表达研究在观察组织反应和生长方面具有额外优势。在我们的实验流程中，GFP使我们能够随时间连续监测同一组织样本中的基因表达，因为GFP的检测具有非破坏性。此外，我们所使用的GFP蛋白具有足够的稳定性以便检测，同时又具备一定的降解 turnover，可避免在植物组织中过度积累，从而让我们能够同时观察基因表达的上升和下降过程。
我们已将机器人图像采集与分析系统应用于多种场景。我们预见该系统在许多需要动态理解现象的生物学应用中具有巨大潜力。例如，可利用本系统追踪植物组织的生长与发育，从而深入了解这些过程。此外，通过绿色荧光蛋白（gfp）等报告基因标记的蛋白质转运动态，也可借助延时动画轻松实现可视化。本报告所述方法在技术上较为复杂，但在概念上十分简洁。我们的研究结果具有高度可重复性，且新的应用正不断被发现。
致谢
薪资和研究支持由美国大豆委员会以及划拨给俄亥俄州立大学/俄亥俄农业研究与发展中心的州级和联邦资金提供。本研究还部分得到了墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT）向CMHG提供的博士后奖学金资助。提及商标或专有产品并不构成俄亥俄州立大学/俄亥俄农业研究与发展中心对该产品的保证或担保，也不意味着排除其他可能同样适用的产品而予以批准。期刊文章编号 HCS 09-17。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| ImageJ | 软件 | 美国国立卫生研究院 | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
参考文献
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