小鼠B细胞CD40激活模型

摘要

在本视频中，我们演示了从小鼠C57BL/6脾细胞中分离并激活扩增B细胞的实验步骤，这些B细胞可作为模型抗原呈递细胞（APC）用于研究免疫应答的诱导。

摘要

关于B细胞的研究表明，CD40激活可增强其抗原呈递能力。在白细胞介素-4和CD40配体（CD40L）刺激下，人B细胞可在14天内从小量外周血样本中轻松扩增，获得大量高纯度的CD40-B细胞（>10⁹每位患者细胞数）来自健康供体以及癌症患者^1-4CD40-B 细胞表达重要的淋巴结归巢分子，并可招募 T 细胞in vitro⁵此外，它们能高效地摄取、加工并提呈抗原给T细胞^6,7CD40-B细胞不仅能够激活初始T细胞，还能够扩增记忆T细胞^8,9因此，CD40活化的B细胞（CD40-B细胞）已被研究作为基于细胞的免疫治疗中一种替代性的免疫刺激性抗原呈递细胞（APC）来源1,5,10。为了进一步研究CD40-B细胞是否能在体内诱导有效的T细胞应答，并探讨其潜在机制，我们建立了一种用于生成小鼠CD40活化B细胞的细胞培养体系。以C57BL/6小鼠的脾细胞或纯化的B细胞进行CD40活化，确定的最佳条件如下：从C57BL/6小鼠（单倍型H-2b）的脾细胞开始，通过密度梯度离心法纯化淋巴细胞，并与表达重组小鼠CD40配体（tmuCD40L HeLa）的HeLa细胞共培养¹¹. 细胞每 3-4 天传代一次，并补充关键组分，如 CD40L、白细胞介素-4、-巯基乙醇和环孢素 A。本方案中，我们展示了如何获得完全活化的鼠源 CD40-B 细胞（mCD40B），其抗原呈递细胞（APC）表型与人 CD40-B 细胞相似（图 1a,b）。经 CD40 刺激后，在细胞培养的 14 天内可实现高度纯化（>90%）的 CD19+ B 细胞快速扩增（图 1c,d）。为避免未转染细胞的污染，需定期检测转染细胞上鼠源 CD40 配体的表达情况（图 2）。鼠源 CD40 活化的 B 细胞可用于研究 B 细胞的活化与分化过程，也可用于体外和体内评估其作为抗原呈递细胞的功能潜力。此外，这些细胞是开发针对肿瘤的治疗性或预防性疫苗的有力工具，并有助于解答该策略在安全性和免疫原性方面的相关问题。¹².

方案

从小鼠脾细胞生成小鼠CD40活化B细胞（mCD40B）的实验方案分为两部分：A部分介绍表达小鼠CD40配体（CD40L）的HeLa细胞（tmuCD40L HeLa）的制备，该细胞将用作包被于培养板上的饲养细胞；B部分描述实际的小鼠CD40-B细胞培养过程。

A. 饲养细胞（tmuCD40L HeLa）的制备

tmuCD40L HeLa 是一种贴壁生长的人上皮细胞系，不应使其完全汇合。因此，细胞需每周传代两次。不建议培养超过 6 周。

1. 使用无菌移液管从原代培养物中移除旧培养基，并用 10 mL 的 1× PBS 洗涤细胞。洗涤后吸除 PBS。
2. 在 75 cm² 培养瓶中加入 4 mL 的 1× 胰蛋白酶/EDTA，于 37°C 孵育 10–15 分钟。轻轻敲击培养瓶以使细胞脱落。
3. 加入 10 mL 野生型培养基，轻轻旋转以终止胰蛋白酶消化作用。
4. 使用无菌移液管将细胞悬液转移至 50 mL 离心管中，在 265 × g 条件下离心 7 分钟，使细胞沉淀。
5. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 10 mL 野生型培养基中。计数细胞悬液部分样品的细胞数量，并根据所需细胞数准备三个 50 mL 离心管：
   1. 传代用：2.5 × 10⁶ 个细胞
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讨论

该方案的修改是可行的，尤其是在CD40刺激来源和所用小鼠品系类型方面，同样可有效生成小鼠CD40活化B细胞。Ahmadi等已证明转染了小鼠CD40配体的鼠源成纤维细胞可获得类似结果。在此情况下可明确排除异种抗原的呈递，但有关安全性与毒性的深入研究 体内 在此使用人源转染的HeLa细胞的实验条件下，未观察到炎症或自身免疫反应的迹象。然而，据我们所知，最佳的替代方案是一种兼具激活和促增殖活性的可溶性小鼠CD40配体，但该试剂目前尚无商业供应。

该方案也适用于129S2/SvPas小鼠（单倍型H-2b）的淋巴细胞，但目前尚未评估其他小鼠品系的应用效果。此外，细胞密度、细胞因子浓度、环孢素A处理时间、细胞培养基和培养皿等条件的调整，也可能实现小鼠B细胞高效的CD40激活并获得相似的增殖速率。然而，本研究已投入大量工作对系统进行优化，以最大程度地提高激活效率和增殖率，最终形成了当前的实验体系。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A. 培养基的制备：
1. 饲养细胞野生型培养基
RPMI 1640
L-谷氨酰胺，300 μg/mL
FBS，10%
HEPES，10 mM
庆大霉素，15 μg/mL
2. 饲养细胞筛选培养基
RPMI 1640
L-谷氨酰胺，300 μg/mL
FBS，10%
HEPES，10 mM
庆大霉素，15 μg/mL
潮霉素B，0.2 mg/mL
3. mCD40-B洗涤培养基
D-MEM
L-谷氨酰胺，580 μg/mL
葡萄糖，4.5 mg/mL
HEPES，10 mM
庆大霉素，15 μg/mL
4. mCD40-B培养培养基
D-MEM
L-谷氨酰胺，580 μg/mL
葡萄糖，4.5 mg/mL
HEPES，10 mM
庆大霉素，15 μg/mL
MEM，0.1 mM (1x)
FBS，10%
B. 其他试剂：
RPMI 1640	Invitrogen	REF 21875
D-MEM	Invitrogen	REF 41965
Dulbecco’s PBS (10x)	PAA Laboratories	Cat No H15-011
庆大霉素®	Delta Select	Art No 7395800
FBS	Lonza Inc.	Cat No DE14-802C
HEPES缓冲液	PAA Laboratories	Cat No S11-001
MEM非必需氨基酸（NEAA）	Invitrogen	REF 11140
潮霉素B	PAA Laboratories	Cat No P02-015
重组小鼠白细胞介素-4	Immunotools	Cat No 12340045
环孢素A	诺华公司（Novartis AG）	Cat No NDC 0078-0109-01
胰蛋白酶/EDTA (10x)	Invitrogen	REF 15400-054
C. 其他耗材：
无菌移液器吸头	Sarstedt Ltd
6孔板	Nalge Nunc international	Cat No 140675
50 mL锥形管	BD Biosciences	Cat No 352070
组织培养瓶	Sarstedt Ltd	Cat No 83.1813.002