在本视频中，我们演示了从小鼠C57BL/6脾细胞中分离并激活扩增B细胞的实验步骤，这些B细胞可作为模型抗原呈递细胞（APC）用于研究免疫应答的诱导。
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摘要
摘要
关于B细胞的研究表明，CD40激活可增强其抗原呈递能力。在白细胞介素-4和CD40配体（CD40L）刺激下，人B细胞可在14天内从小量外周血样本中轻松扩增，获得大量高纯度的CD40-B细胞（>109每位患者细胞数）来自健康供体以及癌症患者1-4CD40-B 细胞表达重要的淋巴结归巢分子，并可招募 T 细胞in vitro5此外，它们能高效地摄取、加工并提呈抗原给T细胞6,7CD40-B细胞不仅能够激活初始T细胞，还能够扩增记忆T细胞8,9因此，CD40活化的B细胞（CD40-B细胞）已被研究作为基于细胞的免疫治疗中一种替代性的免疫刺激性抗原呈递细胞（APC）来源1,5,10。为了进一步研究CD40-B细胞是否能在体内诱导有效的T细胞应答，并探讨其潜在机制，我们建立了一种用于生成小鼠CD40活化B细胞的细胞培养体系。以C57BL/6小鼠的脾细胞或纯化的B细胞进行CD40活化，确定的最佳条件如下：从C57BL/6小鼠（单倍型H-2b）的脾细胞开始，通过密度梯度离心法纯化淋巴细胞，并与表达重组小鼠CD40配体（tmuCD40L HeLa）的HeLa细胞共培养11. 细胞每 3-4 天传代一次，并补充关键组分，如 CD40L、白细胞介素-4、-巯基乙醇和环孢素 A。本方案中，我们展示了如何获得完全活化的鼠源 CD40-B 细胞（mCD40B），其抗原呈递细胞（APC）表型与人 CD40-B 细胞相似（图 1a,b）。经 CD40 刺激后，在细胞培养的 14 天内可实现高度纯化（>90%）的 CD19+ B 细胞快速扩增（图 1c,d）。为避免未转染细胞的污染，需定期检测转染细胞上鼠源 CD40 配体的表达情况（图 2）。鼠源 CD40 活化的 B 细胞可用于研究 B 细胞的活化与分化过程，也可用于体外和体内评估其作为抗原呈递细胞的功能潜力。此外，这些细胞是开发针对肿瘤的治疗性或预防性疫苗的有力工具，并有助于解答该策略在安全性和免疫原性方面的相关问题。12.
方案
从小鼠脾细胞生成小鼠CD40活化B细胞（mCD40B）的实验方案分为两部分：A部分介绍表达小鼠CD40配体（CD40L）的HeLa细胞（tmuCD40L HeLa）的制备，该细胞将用作包被于培养板上的饲养细胞；B部分描述实际的小鼠CD40-B细胞培养过程。
A. 饲养细胞（tmuCD40L HeLa）的制备
tmuCD40L HeLa 是一种贴壁生长的人上皮细胞系，不应使其完全汇合。因此，细胞需每周传代两次。不建议培养超过 6 周。
- 使用无菌移液管从原代培养物中移除旧培养基，并用 10 mL 的 1× PBS 洗涤细胞。洗涤后吸除 PBS。
- 在 75 cm2 培养瓶中加入 4 mL 的 1× 胰蛋白酶/EDTA，于 37°C 孵育 10–15 分钟。轻轻敲击培养瓶以使细胞脱落。
- 加入 10 mL 野生型培养基，轻轻旋转以终止胰蛋白酶消化作用。
- 使用无菌移液管将细胞悬液转移至 50 mL 离心管中，在 265 × g 条件下离心 7 分钟，使细胞沉淀。
- 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 10 mL 野生型培养基中。计数细胞悬液部分样品的细胞数量，并根据所需细胞数准备三个 50 mL 离心管：
- 传代用：2.5 × 106 个细胞
- 用于小鼠 CD40-B 细胞培养的照射处理：每孔 0.4 × 106 个细胞
- 剩余细胞用于冻存（如需要）。
- 在 265 × g 条件下离心 7 分钟，使细胞沉淀。
- 弃去上清液。
- 用于传代培养：将 2.5 × 106 个细胞重悬于 10 mL 筛选培养基中，接种至 75 cm2 细胞培养瓶（细胞密度为 2.5 × 105 个细胞/mL），于 37°C、5% CO2 条件下培养。每周传代两次。
- 用于小鼠 CD40-B 细胞培养：每块 6 孔板需要 2.4 × 106 个细胞。将 tmuCD40L HeLa 细胞以 0.2 × 106 个细胞/mL 的密度重悬于野生型培养基中，进行 78 Gy 照射。每孔接种 2 mL 细胞悬液，于 37°C、5% CO2 条件下培养。当 tmuCD40L HeLa 细胞贴壁后（至少 4 小时：使用显微镜检查贴壁情况；开始 B 细胞刺激前等待时间不得超过 24 小时），即可使用制备好的培养板进行 B 细胞刺激。（继续进行步骤 B。）
B. 小鼠 CD40-B 细胞培养
一、用于CD40刺激的脾细胞制备（第0天）：
请注意：在继续操作前，需确认饲养细胞已贴壁。每次使用前，务必立即将新鲜配制的小鼠白细胞介素-4、β-巯基乙醇和环孢素A加入培养基中。
- 取出 C57BL/6 小鼠（单倍型 H-2b）的脾脏，用含庆大霉素 [15μg/mL] 的 DMEM 溶液清洗两次，每次 10–20 mL，使用 10 mL 移液枪头将脾脏从一个离心管转移至另一个离心管，避免带入小鼠毛发等污染物。将脾脏通过 100μm 细胞筛进行研磨，并用另外 10 mL 培养基冲洗细胞筛。在室温下以 265 × g 离心 7 分钟沉淀脾细胞，重悬于 7 mL muCD40-B B 细胞培养基中，通过 Ficoll 密度梯度离心法分离淋巴细胞。具体操作为：在 15 mL 离心管中加入 5 mL 预热至室温的小鼠 Pancoll 溶液，将细胞小心铺于其上层，室温下以 450 × g 离心 30 分钟，不启用刹车。
- 吸除大部分上层液体，保留位于界面处的淋巴细胞层不受干扰。将淋巴细胞层转移至新的 50 mL 离心管中，用含庆大霉素 [15μg/mL] 的 DMEM 溶液洗涤一次，加入 30 mL 培养基后以 265 × g 离心 7 分钟，以去除其他细胞类型。弃去上清液，将细胞重悬于 10 mL mCD40-B 洗涤培养基中。取部分细胞悬液测定细胞数量。通过计数部分细胞悬液确定细胞总数。
- 以 265 × g 离心 7 分钟，沉淀所需数量的细胞。对于 6 孔板，每孔需要 5 × 106 个细胞，因此每块板共需 30 × 106 个细胞。
- 弃去上清液，将淋巴细胞重悬于新鲜配制的 mCD40-B 培养基中，调整细胞密度为 1.25 × 106 个细胞/mL，培养基中需新鲜添加 1 U/mL 白细胞介素-4 作为生长因子、100 μM β-巯基乙醇以及 0.63 μg/mL 环孢素 A，以防止 T 细胞过度生长（所给浓度均为每毫升培养基中的含量）。
- 移除预先接种了 tmuCD40L HeLa 细胞的 6 孔板中的上清液。
- 轻柔地将 4 mL 淋巴细胞悬液（1.25 × 106 个细胞/mL）加入 6 孔板的每个孔中。
- 将培养板置于 37°C、5 % CO2 条件下孵育。
- 第 3 天进行细胞传代培养（继续进行步骤 II.1.）。
II. mCD40B 细胞的传代培养（第 3 天开始，之后每周两次）：
- 使用10 mL移液器剧烈吹打，收集mCD40B细胞团块，并将其转移至50 mL离心管中。
- 在265 × g条件下离心7分钟，弃去上清液，并用mCD40-B洗涤培养基完全重悬细胞。在对部分细胞进行计数的同时，再次以265 × g离心7分钟。将mCD40B细胞重悬于mCD40-B培养基中，调整细胞浓度至0.75 × 106 个细胞/mL。
- 向培养基中添加新鲜配制的小鼠白细胞介素-4（终浓度为1 U/mL）、100 μM β-巯基乙醇和0.63 μg/mL环孢素A。
- 移除预先接种了经辐照的tmuCD40L HeLa细胞的6孔板中的上清液。
- 轻柔地将4 mL mCD40B细胞悬液（0.75 × 106 个细胞/mL）加入6孔板的每个孔中。
- 将培养板置于37°C、含5% CO2的培养箱中孵育。
- 每3–4天传代一次，经过总共14天后，可获得高纯度的小鼠CD40活化B细胞。
C. 故障排除：如果CD40-B细胞不生长怎么办？
- 您是否检测了饲养细胞的CD40配体表达？
- 用于刺激的平板包被饲养细胞使用时是否超过24小时？
- 是否存在支原体污染？
- 补充用的白细胞介素-4溶液是否 freshly thawed（新鲜解冻），并具有适当的生物学活性？
- β-巯基乙醇和环孢素A是否以正确的浓度添加？
图1a.
图1b.
图 1d.
图 2。
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讨论
该方案的修改是可行的，尤其是在CD40刺激来源和所用小鼠品系类型方面，同样可有效生成小鼠CD40活化B细胞。Ahmadi等已证明转染了小鼠CD40配体的鼠源成纤维细胞可获得类似结果。在此情况下可明确排除异种抗原的呈递，但有关安全性与毒性的深入研究 体内 在此使用人源转染的HeLa细胞的实验条件下，未观察到炎症或自身免疫反应的迹象。然而，据我们所知，最佳的替代方案是一种兼具激活和促增殖活性的可溶性小鼠CD40配体，但该试剂目前尚无商业供应。
该方案也适用于129S2/SvPas小鼠（单倍型H-2b）的淋巴细胞，但目前尚未评估其他小鼠品系的应用效果。此外，细胞密度、细胞因子浓度、环孢素A处理时间、细胞培养基和培养皿等条件的调整，也可能实现小鼠B细胞高效的CD40激活并获得相似的增殖速率。然而，本研究已投入大量工作对系统进行优化，以最大程度地提高激活效率和增殖率，最终形成了当前的实验体系。
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披露
实验操作均遵循国家及欧洲关于实验动物饲养的指导原则。根据德国动物福利法，相关动物由主管部门定期进行监管。
致谢
我们衷心感谢 Clemens Wendtner 博士提供 tmuCD40-Ligand-HeLa 细胞系。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| A. 培养基的制备： | |||
| 1. 饲养细胞野生型培养基 | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-谷氨酰胺，300 μg/mL | |||
| FBS，10% | |||
| HEPES，10 mM | |||
| 庆大霉素，15 μg/mL | |||
| 2. 饲养细胞筛选培养基 | |||
| RPMI 1640 | |||
| L-谷氨酰胺，300 μg/mL | |||
| FBS，10% | |||
| HEPES，10 mM | |||
| 庆大霉素，15 μg/mL | |||
| 潮霉素B，0.2 mg/mL | |||
| 3. mCD40-B洗涤培养基 | |||
| D-MEM | |||
| L-谷氨酰胺，580 μg/mL | |||
| 葡萄糖，4.5 mg/mL | |||
| HEPES，10 mM | |||
| 庆大霉素，15 μg/mL | |||
| 4. mCD40-B培养培养基 | |||
| D-MEM | |||
| L-谷氨酰胺，580 μg/mL | |||
| 葡萄糖，4.5 mg/mL | |||
| HEPES，10 mM | |||
| 庆大霉素，15 μg/mL | |||
| MEM，0.1 mM (1x) | |||
| FBS，10% | |||
| B. 其他试剂： | |||
| RPMI 1640 | Invitrogen | REF 21875 | |
| D-MEM | Invitrogen | REF 41965 | |
| Dulbecco’s PBS (10x) | PAA Laboratories | Cat No H15-011 | |
| 庆大霉素® | Delta Select | Art No 7395800 | |
| FBS | Lonza Inc. | Cat No DE14-802C | |
| HEPES缓冲液 | PAA Laboratories | Cat No S11-001 | |
| MEM非必需氨基酸（NEAA） | Invitrogen | REF 11140 | |
| 潮霉素B | PAA Laboratories | Cat No P02-015 | |
| 重组小鼠白细胞介素-4 | Immunotools | Cat No 12340045 | |
| 环孢素A | 诺华公司（Novartis AG） | Cat No NDC 0078-0109-01 | |
| 胰蛋白酶/EDTA (10x) | Invitrogen | REF 15400-054 | |
| C. 其他耗材： | |||
| 无菌移液器吸头 | Sarstedt Ltd | ||
| 6孔板 | Nalge Nunc international | Cat No 140675 | |
| 50 mL锥形管 | BD Biosciences | Cat No 352070 | |
| 组织培养瓶 | Sarstedt Ltd | Cat No 83.1813.002 |
参考文献
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