本文详细描述了一种对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）细胞中DNA修复复合物实时形成过程进行成像的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
原核生物和真核生物均会通过一系列复杂的生理变化来响应DNA损伤。多种DNA损伤和错配的DNA碱基对可刺激基因表达的改变、已有蛋白质的重新分布以及新蛋白质复合物的组装。荧光显微镜作为一种强大的实验工具，已被用于在活细胞复杂的亚细胞结构中可视化和定量这些对DNA损伤的响应，并监测DNA复制状态。通过将荧光报告蛋白与DNA复制和修复机制的组分进行翻译融合，已用于确定将DNA修复蛋白靶向其对应损伤位点的信号线索in vivo并了解这些蛋白质在细菌细胞内的组织方式。此外，与DNA损伤诱导型启动子相连的转录和翻译融合报告系统揭示了群体中哪些细胞激活了基因毒性应激反应。在本综述中，我们提供了利用荧光显微镜对单个细菌细胞中DNA修复和DNA复制复合物的组装进行成像的详细实验方案。特别是，本研究重点对错配修复蛋白、同源重组、DNA复制以及一种SOS诱导型蛋白的成像进行了阐述Bacillus subtilis此处所述的所有步骤均适用于对多种细菌物种中的蛋白质复合物进行成像。
方案
用于显微镜观察的细胞培养
1. 成像前一至两天，准备含有您希望观察的翻译融合蛋白的 B. subtilis 菌株。需要进行步骤1A和1B的试运行，以确定哪种培养条件可为您的菌株提供最佳图像。大多数情况下，应在对数生长阶段对细胞进行成像。
- 对于某些 B. subtilis 菌株（特别是由于在内源位点整合了目的基因与 GFP 的翻译融合而导致生长不良的菌株），成像前需进行为期两天的初始培养以获得高质量图像。第一天，在含有选择性抗生素的 LB 琼脂平板上划线接种待成像的 B. subtilis 菌株，并于 30°C 培养过夜。第二天，用单个菌落接种 100 μl 0.85% 生理盐水，并在含选择性抗生素的 LB 琼脂平板上进行三次 10 倍系列稀释，每个稀释度各取 100 μl 涂布，随后于 30°C 培养过夜。第三天，选择细胞呈轻度融合生长的稀释平板。平板上轻度融合的生长状态可为后续培养提供健康且处于指数生长期的起始接种物，从而有望获得优异的成像结果（见步骤 4）。此步骤对于使用染料 FM4-64 进行最高质量的膜成像尤为有用。
- 其他 B. subtilis 菌株则可在成像前一天直接用无菌接种针蘸取单菌落接种于选择性 LB 琼脂培养基上，并于 30°C 培养过夜。次日，该平板上的菌体即可作为成像用的接种物（见步骤 4）。
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讨论
寻找每种菌株获得最高质量图像的曝光条件需要进行反复试验；我们发现，白光图像的曝光时间以1毫秒为宜，而GFP（FITC）和FM4-64（TRITC）图像的曝光时间则在100至2000毫秒之间较为合适。曝光时间会因所使用的成像设备不同而有所变化。为简化成像过程，建议每个15孔载玻片上只使用一种菌株，因为如果同一载玻片上存在多种菌株，琼脂糖垫的质量以及细胞从垫边缘扩散可能会影响菌株的区分。图像质量直接取决于细菌所处琼脂糖垫的质量。当细菌并排排列时，从琼脂糖垫上获得的图像质量最高。若琼脂糖垫导致细菌细胞聚集，无法形成单层，则会得到质量较差的图像。过厚的垫会产生较高的背景荧光信号，而脱水的垫则无法使细胞正常贴附。这些琼脂糖垫的缺陷通常会导致图像质量显著下降。若某个孔成像效果不佳，可直接转至下一个孔进行成像。每幅图像中捕获50至200个细胞为宜。荧光显微镜技术已提供了大量信息，详细揭示了指导DNA修复和复制蛋白组装成焦点的细胞信号 体内通过练习，该技术可成功应用于多种细菌物种中的多种蛋白质复合物。
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致谢
作者谨此感谢Philina S. Lee博士和Alan D. Grossman博士最初对L.A.S.在荧光显微镜技术方面的培训。作者还感谢Melanie Berkmen博士和Hajime Kobayashi博士在成像方面提供的帮助与建议。本研究得到了密歇根大学文学、科学与艺术学院以及分子、细胞与发育生物学系启动资金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 特定溶液配方1: | |||
| 10x S750 盐 0.5 M MOPS 100 mM 硫酸铵 50 mM 磷酸二氢钾 过滤除菌，并包裹 S750 储存前将培养基用铝箔包裹 | |||
| 100倍金属溶液 0.2 M MgCl2 70 mM CaCl2 5 mM MnCl2 0.1 mM ZnCl₂2 100 μg/mL 盐酸硫胺素 2 mM HCl 0.5 mM FeCl3* dH2O至终体积 FeCl3 最后添加，以防止沉淀。 过滤除菌后，用铝箔包裹100倍金属溶液。 | |||
| S750 培养基 1x S750 盐类 1x 金属 1% 葡萄糖 0.1% 谷氨酸 40 μg/mL 色氨酸 40 μg/mL 苯丙氨酸 蒸馏水 H2O至终体积 | |||
| 10x Spizizens（克/升） 151.4 mM 硫酸铵（20 g/L） 803.8 mM 磷酸二氢钾（140 g/L） 440.9 mM 磷酸氢二钾（60 g/L） 34.0 mM 柠檬酸钠（10 g/L） 16.6 mM MgSO₄4 (2 g/L) dH2O至终体积 过滤除菌 |
参考文献
- Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).
- Berkmen, M. B., Grossman, A. D. Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle. Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C.
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