成像DNA损伤修复及细胞对DNA损伤的应答 枯草芽孢杆菌

摘要

本文详细描述了一种对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）细胞中DNA修复复合物实时形成过程进行成像的实验方案。

摘要

原核生物和真核生物均会通过一系列复杂的生理变化来响应DNA损伤。多种DNA损伤和错配的DNA碱基对可刺激基因表达的改变、已有蛋白质的重新分布以及新蛋白质复合物的组装。荧光显微镜作为一种强大的实验工具，已被用于在活细胞复杂的亚细胞结构中可视化和定量这些对DNA损伤的响应，并监测DNA复制状态。通过将荧光报告蛋白与DNA复制和修复机制的组分进行翻译融合，已用于确定将DNA修复蛋白靶向其对应损伤位点的信号线索in vivo并了解这些蛋白质在细菌细胞内的组织方式。此外，与DNA损伤诱导型启动子相连的转录和翻译融合报告系统揭示了群体中哪些细胞激活了基因毒性应激反应。在本综述中，我们提供了利用荧光显微镜对单个细菌细胞中DNA修复和DNA复制复合物的组装进行成像的详细实验方案。特别是，本研究重点对错配修复蛋白、同源重组、DNA复制以及一种SOS诱导型蛋白的成像进行了阐述Bacillus subtilis此处所述的所有步骤均适用于对多种细菌物种中的蛋白质复合物进行成像。

方案

用于显微镜观察的细胞培养

1. 成像前一至两天，准备含有您希望观察的翻译融合蛋白的 B. subtilis 菌株。需要进行步骤1A和1B的试运行，以确定哪种培养条件可为您的菌株提供最佳图像。大多数情况下，应在对数生长阶段对细胞进行成像。

1. 对于某些 B. subtilis 菌株（特别是由于在内源位点整合了目的基因与 GFP 的翻译融合而导致生长不良的菌株），成像前需进行为期两天的初始培养以获得高质量图像。第一天，在含有选择性抗生素的 LB 琼脂平板上划线接种待成像的 B. subtilis 菌株，并于 30°C 培养过夜。第二天，用单个菌落接种 100 μl 0.85% 生理盐水，并在含选择性抗生素的 LB 琼脂平板上进行三次 10 倍系列稀释，每个稀释度各取 100 μl 涂布，随后于 30°C 培养过夜。第三天，选择细胞呈轻度融合生长的稀释平板。平板上轻度融合的生长状态可为后续培养提供健康且处于指数生长期的起始接种物，从而有望获得优异的成像结果（见步骤 4）。此步骤对于使用染料 FM4-64 进行最高质量的膜成像尤为有用。
   
2. 其他 B. subtilis 菌株则可在成像前一天直接用无菌接种针蘸取单菌落接种于选择性 LB 琼脂培养基上，并于 30°C 培养过夜。次日，该平板上的菌体即可作为成像用的接种物（见步骤 4）。
   
   注意：对于 B. subtilis，液体培养基中的过夜培养并不合适，因为芽孢形成和群体感应反应的共同作用会导致较长的滞后期 ¹。

2. 成像当天早晨，将10 mL S7₅₀ ^1-3 培养基加入一个125 mL的无菌锥形瓶中。

3. 用最多2 mL的S7₅₀培养基重悬LB琼脂平板上的单菌落或轻度融合生长的细胞，以制备接种物。

4. 向含有10 mL S7₅₀培养基的锥形瓶中加入足量的S7₅₀培养基-菌液接种物，使培养液初始在600 nm处测得的光密度（OD₆₀₀）约为0.08至0.1。此步骤中，必须保证至少10倍的空气与培养基体积比，因此我们在125 mL锥形瓶中使用10至12.5 mL的接种培养基。

5. 将每种培养物在30°C下培养，直至培养物的OD₆₀₀达到约0.5–0.8。建议使用振荡水浴摇床，转速为每分钟150–200转。使用DNA损伤剂或错配诱导剂处理的培养物，应处于对数生长早期的OD₆₀₀，以确保在所需处理时间（见表1）的额外培养后，细胞能够达到目标OD₆₀₀。
例如，2-氨基嘌呤需要处理一小时，因此经2-氨基嘌呤处理的培养物应处于OD₆₀₀约0.3–0.4的阶段，使得经过一小时的处理/生长后，OD₆₀₀达到约0.5–0.8，此时细胞已准备好用于成像。

样品制备

1. 用移液器将300 μl培养的细胞转入1.5 mL微量离心管中。

2. 若需对细胞膜进行成像，可将FM4-64膜染料（Invitrogen）从1 mg/mL的储存液中按1:1000稀释后加入各样品中。为获得理想的荧光信号，可能需要对FM4-64进行滴定优化。典型的滴定浓度范围为1:100、1:1000和1:10,000。

3. 将样品在室温下静置最多十分钟，或在制备载玻片的同时进行静置，载玻片制备方法如下所述（见“载玻片制备”中的步骤1），即使用1%琼脂糖的1X Spizizens培养基。

4. 如果需要浓缩细胞，我们更倾向于使用0.2 μm滤膜和真空装置过滤细胞。随后可在观察前用PBS、其他合适的缓冲液或培养基轻轻将细胞从滤膜表面洗脱下来。

载玻片制备

1. 配制含1X Spizizens的1%琼脂糖凝胶。

取5 mL 10X Spizizens母液加入45 mL ddH2O中，再加入0.5 g琼脂糖，微波加热至完全溶解。高温熔化的琼脂糖难以用移液器操作，而凝固的琼脂糖则无法吸入移液器吸头。应将琼脂糖溶液置于水浴中平衡至约55–65°C，以便在移液过程中不会在吸头内凝固。

2. 用移液器枪头吸取含有1%熔化琼脂糖的20 μl Spizizen溶液。将琼脂糖溶液轻轻挤出，每孔滴加一滴（约1–2 μL）至载玻片的每个孔中（我们使用15孔载玻片，见表2），形成浅层琼脂糖垫。琼脂糖会立即凝固。载玻片必须在细胞接种前即刻制备。若琼脂糖垫单独置于室温下，数分钟内即可脱水，导致无法使用。

琼脂糖垫应居中放置并填满每个孔，但高度应尽量低，以避免干扰盖玻片；若液滴过高（呈气泡状）或样品扩散超出孔的边界，可用Kimwipe纸巾将孔擦拭干净后重新添加新的琼脂糖垫。

3. 将全部300 μl样品（见步骤6）加到载玻片上，均匀分布在每个琼脂糖垫的顶部。此细胞量应足以覆盖载玻片上的每个孔。

4. 将载有细胞的载玻片在室温（23°C）下静置约十分钟。此步骤可使细胞沉降到琼脂糖垫上，从而固定不动，准备成像。根据特殊实验需求，该温度可能需要调整，例如在进行需要温度变化的实验时⁴。

5. 吸去每个孔中多余的培养基，注意不要移走垫片本身。

6. 将盖玻片盖在载玻片上，均匀而轻柔地在整个玻片区域施加压力。检查盖玻片是否紧贴载玻片，确保盖玻片没有翘起或高于载玻片表面。

细胞的可视化

1. 多种不同的荧光显微镜均可良好工作。关键是要配备100倍油镜。Simmons实验室使用的是：

• 配备1.45数值孔径（NA）TIRFM 100倍油浸物镜的Olympus BX61显微镜
• Hamamatsu ORCAR² CCD制冷相机
• Prior Lumen 200弧光金属光源
• 用于GFP（FITC）检测，滤光片激发波长为460-500，发射波长为510-560
• 用于FM4-64（TRITC）检测，滤光片激发波长为510-560，发射波长为572-648
• 图像使用SlideBook 4.2采集（图1）

2. 使用白光将细胞调至焦点。

3. 使用适用于每种荧光染料的适当滤光片捕获图像。

代表性结果

图1展示了代表性图像。GFP焦点应清晰可辨，而FM4-64染色应明亮且清晰^4-7。GFP或膜图像可用任意颜色进行伪彩处理，以便在不丢失任何数据的情况下呈现最高质量的图像。

图1：枯草芽孢杆菌（B. subtilis）翻译融合蛋白的代表性GFP图像。 GFP蛋白显示为绿色，FM4-64膜染色显示为红色。白色比例尺表示3 μm。（A） MutS-GFP［相关基因型：mutS-gfp (spc)，amyE::PspacmutL (cat)］，在含有600 μg/mL 2-氨基嘌呤和1 mM IPTG的条件下。未显示FM4-64信号，以便更清晰地展示MutS-GFP焦点。（B） MutL-GFP［相关基因型：mutL::mutL-GFP (spc)］，在含有2-氨基嘌呤的条件下。（C） DnaX-GFP［相关基因型：dnaX::dnaX-GFP (spc)］。（D） RecA-GFP［相关基因型：recA::recA-GFP (spc)］，在含有20 ng/mL丝裂霉素C的条件下。（E） TagC-GFP［相关基因型：tagC::tagC-GFP (spc)］，在含有1 μg/mL丝裂霉素C的条件下。

处理方法 / 浓度或剂量	功能	孵育时间
Mitomycin C (MMC) [20 至 150 ng/mL]	DNA 烷基化试剂	1 小时
2-氨基嘌呤 (2-AP) [600 μg/mL]	诱导错配	1 小时
羟基脲 (HU)	耗竭 dNTP	3 小时
紫外线 (UV) 20 J/m²	胸腺嘧啶-胸腺嘧啶二聚体及 6-4 光产物	根据光源不同而变化，通常为 20 秒
戈瑞 (电离辐射) 5 至 100 Gy	双链断裂、单链断裂及碱基损伤位点	根据光源不同而变化

表1. DNA损伤与错配诱导处理方法汇总

试剂名称	公司	目录编号	备注（可选）
Multitest slide, 15-well	MP Biomedicals	6041505E
Microscope Cover Glass	Fisher	12-544-B
Agarose	Fisher	BP160-500
Mitomycin C	Sigma	M0503-2MG	诱变剂，需戴手套
2-Aminopurine	Sigma	A3509-250MG	需戴手套
Hydroxyurea	Sigma	H8627-25G	需戴手套
FM4-64	Invitrogen	T13320	避光

表2. 特定试剂与设备列表：

讨论

寻找每种菌株获得最高质量图像的曝光条件需要进行反复试验；我们发现，白光图像的曝光时间以1毫秒为宜，而GFP（FITC）和FM4-64（TRITC）图像的曝光时间则在100至2000毫秒之间较为合适。曝光时间会因所使用的成像设备不同而有所变化。为简化成像过程，建议每个15孔载玻片上只使用一种菌株，因为如果同一载玻片上存在多种菌株，琼脂糖垫的质量以及细胞从垫边缘扩散可能会影响菌株的区分。图像质量直接取决于细菌所处琼脂糖垫的质量。当细菌并排排列时，从琼脂糖垫上获得的图像质量最高。若琼脂糖垫导致细菌细胞聚集，无法形成单层，则会得到质量较差的图像。过厚的垫会产生较高的背景荧光信号，而脱水的垫则无法使细胞正常贴附。这些琼脂糖垫的缺陷通常会导致图像质量显著下降。若某个孔成像效果不佳，可直接转至下一个孔进行成像。每幅图像中捕获50至200个细胞为宜。荧光显微镜技术已提供了大量信息，详细揭示了指导DNA修复和复制蛋白组装成焦点的细胞信号 体内通过练习，该技术可成功应用于多种细菌物种中的多种蛋白质复合物。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
特定溶液配方1:
10x S750 盐 0.5 M MOPS 100 mM 硫酸铵 50 mM 磷酸二氢钾 过滤除菌，并包裹 S750 储存前将培养基用铝箔包裹
100倍金属溶液 0.2 M MgCl2 70 mM CaCl2 5 mM MnCl2 0.1 mM ZnCl₂2 100 μg/mL 盐酸硫胺素 2 mM HCl 0.5 mM FeCl3* dH2O至终体积 FeCl3 最后添加，以防止沉淀。 过滤除菌后，用铝箔包裹100倍金属溶液。
S750 培养基 1x S750 盐类 1x 金属 1% 葡萄糖 0.1% 谷氨酸 40 μg/mL 色氨酸 40 μg/mL 苯丙氨酸 蒸馏水 H2O至终体积
10x Spizizens（克/升） 151.4 mM 硫酸铵（20 g/L） 803.8 mM 磷酸二氢钾（140 g/L） 440.9 mM 磷酸氢二钾（60 g/L） 34.0 mM 柠檬酸钠（10 g/L） 16.6 mM MgSO₄4 (2 g/L) dH2O至终体积 过滤除菌