从组织外植体培养的人原代支气管上皮细胞

摘要

本文介绍了一种从人支气管气道组织外植体中培养原代人支气管上皮细胞的详细方法，包括在气液界面条件下进行分化生长。该方法可提供充足的原代细胞来源，用于研究气道上皮在人类肺部健康与疾病中的作用。

摘要

人支气管上皮细胞在疾病细胞模型构建以及研究辅料和药理学试剂对人上皮细胞功能与结构影响方面具有重要需求。本文详细描述了从肺部手术（如肺癌或肺减容手术）期间外科医生获取的支气管气道组织中培养支气管上皮细胞的方法。在获得伦理批准和知情同意后，外科医生在完成病理所需取材的基础上，将远离病变区域的支气管组织提供给我们。该组织随后被用作外植体来源，用于体外培养原代支气管上皮细胞。取长约0.5–1 cm、直径≤1 cm的支气管节段，用冷EBSS冲洗，并去除多余的实质组织。将支气管节段剪开并剪碎成2–3 mm大小的组织块³组织块。这些组织块用作原代细胞的来源。将100 mm培养皿用胶原蛋白（30 μg/mL）、纤连蛋白（10 μg/mL）和牛血清白蛋白（10 μg/mL）的混合物包被1–2小时后，在培养皿表面划出4–5道划痕，将组织块置于划痕区域，然后加入适用于上皮细胞生长的培养基（DMEM/Ham F-12，含添加剂），并将培养皿放入37°C、5% CO₂的培养箱中培养₂湿润的空气环境中培养。每3-4天更换一次培养基。上皮细胞从组织块向外生长，约3-4周形成直径约1.5 cm的环状结构。通过将组织块转移至新的预包被培养板中，可重复使用多达6次。细胞用胰蛋白酶/EDTA消化解离，收集后计数，并重新接种于T75 Cell Bind培养瓶中以扩增细胞数量。接种200万至300万个细胞的T75培养瓶，约4周可生长至80%融合度。扩增后的人原代上皮细胞可在气液界面培养并诱导其分化。本文所述方法可从新鲜分离的组织中获得大量人支气管上皮细胞，适用于将这些细胞作为疾病模型进行研究，以及用于药理学和毒理学筛选。

方案

人支气管节段为原代支气管上皮细胞提供了丰富的来源。本文介绍了一种从新鲜分离的人支气管节段中培养和扩增人支气管上皮（HBE）细胞的实验方案。该方案包含五个部分：

1. 包被和划线100 mm培养皿
2. 制备支气管组织外植体
3. 支气管组织移植
4. 原代人支气管上皮细胞传代
5. 在Transwell上培养带纤毛的人支气管上皮细胞

开始前 请注意，除非另有说明，所有步骤均在生物安全柜（BSC）中进行。请确保您已备齐本实验所需的所有材料。请仔细阅读“材料、试剂与准备”部分，并确认您已在无菌条件下（即在生物安全柜或BSC中）配制好以下溶液：
包被储存液： 纤连蛋白（10 μg/ml）、牛血清白蛋白（BSA，10 μg/ml）和胶原蛋白（30 μg/ml）溶于Earle's平衡盐溶液（EBSS，无菌）中。
培养基： DMEM/Ham F-12 培养基，含添加剂、抗生素-抗真菌剂（1%）和胎牛血清（FBS，1%）
消化溶液： 胰蛋白酶/EDTA 储存液，以及含FBS（10%）的DMEM/F-12培养基

1. 包被和划线100 mm培养皿：外植体将接种于100 mm培养皿中。首先用包被液对100 mm培养皿进行包被处理。操作应在生物安全柜（BSC）中进行，保持所有物品无菌。

1. 在生物安全柜（BSC）中放置无菌的 100 mm 培养皿和包被液（胶原蛋白/纤连蛋白/BSA）。
2. 用移液器将 2.0 ml 包被液加入一个 100 mm 培养皿中。
3. 轻轻晃动培养皿，使液体均匀覆盖皿底。确保包被液完全且均匀地覆盖培养皿底部。
4. 吸出剩余的包被液，并用于包被第二个 100 mm 培养皿。根据所需数量重复此步骤。所需培养皿的数量取决于组织外植体的数量。
5. 确保包被液如示范所示均匀覆盖各培养皿底部。
6. 盖上培养皿盖，置于培养箱中干燥 1–2 小时，使用前吸除多余液体，用于支气管组织外植体培养。未使用的包被培养皿可放入无菌袋中，密封后于 4°C 保存以备后续使用（可在冰箱中保存长达一个月）。使用前需恢复至室温。
7. 用 70% 乙醇喷洒清洁小型锋利剪刀、手术刀和镊子，并移入生物安全柜中。用手术刀用力在包被好的培养皿表面划出深而小的“X”形划痕（至少 4 个）。若划痕不够深，组织块将无法嵌入凹槽，容易漂浮。

2. 准备支气管组织外植体

使用术后24-36小时内获取的支气管组织。在使用前，将组织置于EBSS中并保持在冰上。

1. 生物安全柜外操作： 将组织置于培养皿中。用EBSS充分冲洗分离的人支气管组织样本。
2. 剥离多余的周围组织。
3. 剪开支气管组织片段。
4. 将组织移入生物安全柜内，并转移至含冷DMEM/HamF12 + 1% 抗生素/抗真菌剂的无菌100 mm组织培养皿中。
5. 使用锋利的小剪刀将组织剪切成2–3 mm³大小的组织块。
6. 用镊子将一块切割后的组织置于每个“X”形凹槽的中心位置，并轻轻按压。
7. 让组织块（外植块）在培养皿上贴附数秒钟，然后缓慢加入10 ml完全培养基（DMEM/HamF12 + 添加剂 + 1% 抗生素/抗真菌剂 + 1% FBS）。若加入培养基后组织漂浮，可用镊子将组织推入“X”形凹槽的沟槽内，或重新制作新的“X”形标记。若沟槽不够深，可能需要重新制作新的“X”形标记。
8. 将培养皿放入培养箱中，每3–4天更换一次培养基。
9. 当外植块周围已长出足够多的上皮细胞并覆盖1–2 cm区域时，组织即可用于移植。此过程大约需要4周。

3. 支气管组织移植

1. 使用100 mm的包被并划痕处理的培养皿。由于部分组织外植体可能无法成功，所需培养皿的数量取决于您移植的组织块数量。如果使用的是先前已包被并储存在4°C的培养皿，请在使用前恢复至室温。
2. 用镊子小心地从原培养皿中取出组织，置于新培养皿中“X”标记的中心位置，并轻轻按压。无细胞迁出的组织应予以弃用。
3. 让组织在培养皿中贴附数秒钟后，加入培养基，并按照前述外植体培养的方法进行孵育（2.7–2.9）。

4. 人支气管上皮（HBE）细胞的传代

1. 为每个100 mm组织培养皿准备2 ml胰蛋白酶/EDTA储备液，将其解冻。用6 ml无菌0.01 M PBS稀释储备液（即将2 ml储备液加入6 ml PBS中，最终胰蛋白酶浓度为250 μg/ml，EDTA浓度为100 μg/ml）。
2. 将组织块转移至新培养皿后，吸除含有1–2 cm细胞环的培养皿中的培养基。
3. 向每个100 mm培养皿中加入8 ml预热的稀释胰蛋白酶/EDTA溶液，放入37°C培养箱中消化3–15分钟。需频繁观察，消化时间过长会损伤细胞。
4. 在显微镜下观察培养皿，确认大部分细胞已脱落。细胞会变圆并脱离皿底，如图所示。
5. 每皿加入8 ml含10% FBS的预热培养基，以中和胰蛋白酶/EDTA溶液的活性。
6. 将所有培养皿的细胞悬液合并至同一离心管中（若来自不同组织，可分开放置）。使用血细胞计数板进行细胞计数。
7. 以100 × g离心5分钟，管底将形成细胞沉淀。
8. 用完全培养基（DMEM/Ham F12 + 所有添加剂 + 1%抗生素-抗真菌剂 + 1% FBS）重悬细胞沉淀，调整至所需细胞浓度。
9. 每T75培养瓶接种200–300万个细胞，并根据需要添加完全培养基。培养期间每3–4周更换一次培养基。细胞约4周可生长至亚汇合状态（80–90%）。为防止细胞衰老，应在细胞达到亚汇合状态时进行传代扩增或使用。

5. 在 Transwell 小室中培养纤毛化人支气管上皮（HBE）细胞。

从组织外植体/移植体培养获得的原代上皮细胞可传代扩增三次后使用。接种密度为每平方厘米50,000至100,000个细胞² 建议 ^1,2密度越高，分化速度越快。
注意：制备细胞悬液并计数。以每2 ml培养基重悬100万个细胞的浓度重新悬浮。

1. 开始实验前，需预先用培养基（DMEM/Ham F12）孵育transwell细胞培养小室的可渗透膜，以准备其使用。此步骤对这些敏感细胞是必需的，有助于细胞贴附。
   1. 使用适用于24孔多孔板的6.5 mm插入式培养小室。
   2. 向膜的两侧均加入培养基（对于6.5 mm插入小室，底部加0.6 ml，顶部加0.1 ml）。在细胞培养箱中孵育1小时。
   3. 小心地（抽吸）从膜的两侧移除培养基，首先从基底侧开始。
      “小心地”意味着：膜容易受损，因此应将移液管沿培养小室侧壁缓慢加入或移除液体，并使用推荐的体积。若不如此操作，可能导致培养基泄漏至其他孔中。
2. 在可渗透支持膜预孵育后接种细胞
   1. 小心地将细胞悬液加入膜的顶端侧：对于6.5 mm小室，在膜的顶端侧加入0.1 ml细胞悬液（即50,000个细胞）。
   2. 在膜的基底侧加入0.6 ml培养基。
3. 在接下来的10天内，从顶端和基底两侧对细胞进行喂养，以建立良好分化的细胞培养体系：每周更换两次培养基，采用以下示范方法：
   1. 先移除基底侧的培养基
   2. 更换顶端侧的培养基（0.1 ml培养基）
   3. 向膜的基底侧添加0.6 ml新鲜培养基。
   
   该方法有助于促进细胞在膜上的贴附，并防止细胞长时间暴露于空气中（快速更换培养基并立即放回培养箱）。
4. 在第10天通过移除顶端侧培养基，然后在膜的基底侧补充0.6 ml培养基，建立气液界面（ALI）。
5. 维持细胞在气液界面条件下培养6周，每周更换培养基两次。纤毛细胞将在建立气液界面后约4周开始出现。在建立气液界面后6周，细胞将实现向纤毛细胞的均一化分化。

材料准备：

1. 包被储存液的制备（在生物安全柜中进行）：

原代人支气管上皮细胞在包被有纤连蛋白/牛血清白蛋白/胶原的表面生长良好³。上述包被用储存液可用于100 mm组织培养皿，适用于外植体和移植培养。此外，该包被溶液也可用于包被盖玻片，以加快细胞贴壁，随后可将盖玻片用于免疫染色实验。

1. 纤连蛋白（1 mg/ml 储存液）：使用 Sigma 公司的 F2006-2mg。将 2 mg 纤连蛋白溶解于 2 ml 无菌 Earle's 平衡盐溶液（EBSS，Sigma 28888）中，在生物安全柜（BSC）内使用 0.2 μm 注射器滤器过滤。分装 1 ml 至离心管中，于 -20°C 冰箱中保存以备后续使用；另取 1 ml 用于配制 100 ml 包被溶液。
2. 牛血清白蛋白（BSA，1 mg/ml 储存液）：使用 Sigma 公司的 A4919-1g。称取 20 mg BSA，溶于 20 ml 无菌 EBSS 中，在生物安全柜（BSC）内使用 0.2 μm 注射器滤器过滤。分装至 1 ml 离心管中，于 -20°C 冰箱中保存至需要时使用。使用 1 ml 储存液配制 100 ml 包被溶液。
3. 胶原蛋白储存液（Sigma C8919 提供的浓度为 0.1% 或 1 mg/ml）。注意：仅在生物安全柜（BSC）内开启，并在放回冰箱前密封严密。使用 3 ml 储存液配制 100 ml 包被溶液。
4. 包被储存液：在生物安全柜（BSC）内，将 3 ml 胶原蛋白（1 mg/ml）、1 ml 纤连蛋白（1 mg/ml）和 1 ml BSA（1 mg/ml）加入 95 ml 无菌 EBSS 中，充分混匀。分装至 2 ml 离心管中，于 -20°C 冰箱中保存至需要时使用。包被储存液的终浓度为：纤连蛋白（10 μg/ml）、BSA（10 μg/ml）和胶原蛋白（30 μg/ml），溶于 EBSS 中。

2. 培养基的制备（在生物安全柜中进行）： 培养基成分为 Sigma 公司的 DMEM/Ham F-12，添加牛垂体提取物（15 μg/ml）、表皮生长因子（10 ng/ml）以及其他如下所述的添加剂。每次更换培养基时均需新鲜加入抗生素/抗真菌剂（1%）和胎牛血清（1%）。该培养基是在参考了多种描述气道上皮细胞培养方法的文献^3-9后配制而成，旨在实现人支气管上皮细胞的最佳生长。

1. 牛垂体提取物（BPE 1 mg/ml 储存液）： Sigma P1476 （2.5 ml BPE，14 mg/ml 无菌过滤溶液）：将2.5 ml 原液（14 mg/ml）稀释至终浓度为1 mg/ml，即取2.5 ml BPE原液加入32.5 ml无菌EBSS中，配制成1 mg/ml的工作液。分装为7.5 ml等份（共4管7.5 ml等份，1管5 ml等份）。稀释后，将分装样品于-20℃保存°C 保存，直至使用。不建议对复溶后的产品进行长期储存或反复冻融。
2. 表皮生长因子（EGF 10 μg/ml 储存液： Sigma E9644-0.2mg将内容物（0.2 mg）溶于20 ml含0.1% BSA的0.2 mm滤过的10 mM乙酸溶液中（即：将20 mg BSA溶解于20 ml 10 mM乙酸溶液中，过滤后用于EGF的重悬）。分装为0.5 ml每份，保存于-20 °C冰箱中。使用100μl 用于 100 ml 培养基。
3. 肾上腺素（5 mg/ml 储存液）： Sigma E1635. 将10 mg溶于2 ml 1 M过滤的盐酸（HCl）中，分装至50 μl 管，冷冻（-20）°C）。
4. 胰岛素（2 mg/ml 储存液）： Sigma I6634 50 mg。将50 mg溶解于25 ml过滤（0.2 μm）的水中。μm 滤膜）稀释的 HCl（1 mM）。分装至 1.25 ml 小瓶中。
5. 转铁蛋白 人源（50 mg/ml 储存液）： Sigma T8158 100毫克。将100毫克溶于2毫升DH2O中（经0.2微米滤膜过滤） μm 滤膜）。分装至 100μ每管（0.5 ml 离心管）各一份。
6. 三碘-L-甲状腺原氨酸（1 mg/ml 储存液）： Sigma T6397 100毫克。将100毫克溶于100毫升1M过滤的HCl中。分装为每份1毫升。取0.5毫升分装至10份μl 分装。
7. 氢化可的松（5 mg/ml 储存液）： Sigma H0888 称取100 mg，溶于20 ml过滤乙醇中，配制成5 mg/ml的母液。分装至1 ml小瓶中。将1 ml（5 mg/ml）分成50等份μ0.5 ml 小瓶分装
8. 视黄酸（1 mg/ml 储存液，使用时稀释至 0.01 mg/ml）： Sigma R2625 100毫克）。将100毫克溶于10毫升乙醇中，分装为1.0毫升等份。将（1毫升）小瓶分装至50个试管中，每管20微升μ每份各 l，于 -20 冻存°C. 取一个 20μl 小瓶并稀释至 2000μ根据需要，用培养基配制为 0.01 mg/ml 的储存液。
9. 牛血清白蛋白溶液，经无菌过滤，细胞培养测试： Sigma A8412。将溶液置于低温（4 ℃）保存。°C）直至使用前均保持封闭状态。仅在生物安全柜中打开。
10. 抗生素-抗真菌素，Sigma A5955 分装为1 ml体积，于-20℃冷冻保存°C 保存，直至使用。在培养基中使用时，终浓度为 1%。
11. FBS，Sigma F1015 在50℃下灭活FBS°在30分钟内冷却至室温。在生物安全柜中冷却。分装至无菌瓶中，每瓶1 ml和10 ml。在培养基中使用终浓度为1%，在中和胰蛋白酶/EDTA溶液时使用终浓度为10%。
12. 培养基的配制：
    对于500 ml DMEM/HamF12培养基，使用：
    • 1 支 BPE（每支 7.5 ml，1 mg/ml），用于达到 15 的终浓度μg/ml
    • 1管EGF（0.5 ml，10）μg/ml)，终浓度为10 ng/ml。
    • 1管肾上腺素（50μl（5 mg/ml）以获得终浓度0.5μg/ml
    • 1 小瓶胰岛素（1.25 ml，2 mg/ml），用于配制终浓度为 5μg/ml
    • 1 小瓶转铁蛋白（100μl 的 50 mg/ml 溶液，以获得 10 的终浓度μg/ml
    • 5 μ1 mg/ml 的三碘甲状腺原氨酸（Triiodo-L-thyronine）溶液，用于配制终浓度为 10 ng/ml 的工作液。
    • 1 瓶氢化可的松（50μl（5 mg/ml）以获得终浓度0.5μg/ml
    • 5 μl 视黄酸稀释至 0.01 mg/ml，终浓度为 0.1 ng/ml。
    • 10 μ1.5% 牛血清白蛋白溶液μg/ml
    将7.5 ml BPE储备液加入一个500 ml无菌瓶中，并按上述要求加入所有添加剂。   用DMEM/Ham F-12定容至500 ml。将溶液密封后置于冰箱中避光保存。更换培养板中的培养基时，仅分装所需体积，加入新鲜抗生素-抗真菌剂（1%）和FBS（1%），37℃预热后使用。°C 然后使用。

3. 解离溶液的制备：

1. 胰蛋白酶/EDTA 储存液的制备：将 100 mg 胰蛋白酶（Sigma T9935-100mg）和 40 mg EDTA（Sigma E6758）溶解于 500 ml 0.01 M PBS（Sigma E6758）中。分装至 2 ml 小瓶中，于 -20°C 冰箱中保存。 工作液稀释方法：取 2 ml 储存液加入 6 ml PBS 中（胰蛋白酶终浓度为 250 μg/ml，EDTA 终浓度为 100 μg/ml）。
2. 终止酶反应用溶液的制备：在生物安全柜中新鲜配制含 10% FBS 的培养基：将 1 ml FBS 加入 9 ml 培养基（DMEM/Ham F-12）中。每 100 mm 培养皿使用 8 ml 预热的 10% FBS 溶液以中和 8 ml 解离液。

4. 特殊要求：

1. 培养上皮细胞时，需保持所有物品清洁并经过消毒。用于细胞培养的所有试剂均应为无菌状态，或使用0.2 μm滤器过滤。材料和添加剂的配制应在生物安全柜（BSC）中进行。添加或更换培养基也应在生物安全柜中操作。
2. 将头发扎起，如有条件应佩戴一次性帽子，并穿戴实验服和手套。
3. 保持所有工作台面整洁无杂物。每次操作之间用70%乙醇清洁台面，并在处理不同细胞培养物之间至少间隔15分钟。
4. 对所有试剂和培养基瓶进行标记，注明接收日期和配制日期。
5. 定期检查细胞培养物和培养基，观察是否存在明显的细菌或真菌污染。
6. 定期检测支原体污染（如需要）。
7. 更换细胞培养基前，应将培养基预热至37°C。
8. 抗生素/抗真菌剂和胎牛血清（FBS）应在使用前新鲜加入培养基中。
9. 至少每3–4天更换一次培养基。细胞勿长时间置于室温环境中，更换培养基后应立即放回培养箱。

代表性结果：

人支气管上皮细胞的培养特性与形态学

在培养前，对用于培养的支气管节段刷取的人支气管上皮细胞进行显微镜观察，结果显示存在纤毛和非纤毛上皮细胞条带，提示上皮组织正常（图1，补充材料1）。对来自组织块和接种于盖玻片上的细胞的细胞离心涂片进行免疫染色，发现所有细胞均表达上皮特异性细胞角蛋白（图3）。9个支气管组织样本中有8个成功建立了组织块培养，其中1个培养物发生感染。上皮细胞环在3–4周内扩展至1–2 cm半径（图2a）。成功的组织块培养物可连续传代培养最多6次。所有成功的培养中，在移植开始后48小时内即可观察到细胞迁移现象（图2b）。细胞呈典型的鹅卵石样形态，这是此类上皮细胞的显著特征，如图2、图4、图5和图6所示。传代培养的支气管上皮细胞对细胞角蛋白和E-钙黏蛋白均呈均匀阳性免疫染色。使用针对其他细胞类型的特异性抗体进行免疫染色，未发现成纤维细胞、间充质细胞或内皮细胞污染的迹象（分别为α-SMA、波形蛋白和CD31：PECAM-1染色）（图5）。在可渗透的聚酯膜（transwell）上、采用气液界面培养的细胞可分化为纤毛上皮，如图6所示。在transwell上生长的支气管上皮细胞的代表性视频记录显示，细胞已分化并具有规律摆动的纤毛（补充材料2）。

所检测的人支气管上皮细胞培养物的特征见表1。首次传代（P1）的中位时间为4周，平均细胞产量为1510±275万个细胞（n=9个组织）。通过台盼蓝排斥法评估组织块来源细胞及P1代细胞的活力，这些支气管培养物的细胞活力 consistently 较高（99%）。每个组织来源的组织块培养物在首次传代后，将继代培养的细胞合并，用于后续实验。从组织块中回收的平均细胞数量显著高于后续传代培养物（每200万个P1细胞可获得P2代细胞675±240万个，n=5个组织）。其中一个P2代培养物因细胞形态不符合典型上皮细胞特征而被弃用（图7a）。类似地，另两个不同组织的传代培养物（P2和P3代）也被弃用（图7b）。

图1 人支气管组织片段及新鲜分离的纤毛与非纤毛上皮细胞条带。（a）用于原代培养人支气管上皮细胞的代表性人支气管组织片段，长度约1-2 cm，直径<1 cm。（b）从支气管片段刷取的一条人支气管上皮细胞，显示纤毛和非纤毛上皮细胞，放大倍数320倍。带有摆动纤毛的细胞视频见补充视频1。

图2 从移植块在100 mm组织培养皿上培养的人支气管上皮细胞。a）含有2-3 mm³组织的100 mm培养皿。注意约1-2 cm的细胞环，在3-4周后肉眼可见。b）移植块组织边缘及上皮细胞迁移图像，标尺=100 μm。将移植块转移至新培养皿即成为移植物。移植块最多可移植6次。

图3 来自外植体的细胞经上皮特异性细胞角蛋白染色。外植体来源细胞的细胞离心涂片使用单克隆抗广谱细胞角蛋白-FITC（混合物）对细胞角蛋白（绿色）进行染色，该抗体可识别人细胞角蛋白1、4、5、6、8、10、13、18和19。细胞核使用Hoechst染料（蓝色）染色。合并图像显示，由外植体培养出的支气管细胞主要为上皮细胞，比例尺=20μm。

图4 人支气管上皮细胞的继代培养。a) 使用胰蛋白酶/EDTA 将来自组织块和移植组织的细胞从 100 mm 培养皿中消化下来，计数后以每 T75 培养瓶 200–300 万个细胞的密度接种。细胞在 T75 培养瓶中培养 28–30 天后达到亚汇合状态（80–90%）（b, c）。注意上皮细胞典型的铺路石样形态，标尺=100 μm。

图5 通过免疫染色验证亚培养的支气管细胞为上皮细胞。这些细胞对细胞角蛋白-FITC呈阳性染色（绿色）（a,b）；A549上皮细胞中显示了细胞角蛋白-FITC的阳性对照（c），成纤维细胞中显示了阴性对照（d）。培养的支气管细胞 对E-钙黏蛋白/Alexa Fluor 594呈阳性染色（深红色）（i,j），而对α-SMA-cy3（e,f）、波形蛋白/TRITC（m）以及CD31（PECAM-1/FITC）（o）均无染色，表明原代培养的支气管上皮细胞中无平滑肌细胞、间充质细胞或内皮细胞的污染。A549上皮细胞中展示了E-钙黏蛋白/Alexa Fluor 594的阳性对照（深红色）（k）。成纤维细胞中展示了α-SMA-cy3（红色）的阳性对照（g,h）。支气管上皮细胞中展示了Alexa Fluor 594（l）、兔抗小鼠TRITC（n）和驴抗山羊FITC（p）的二抗对照。标尺=20μm。

图6 在Transwell小室中培养的人支气管上皮细胞。纤毛细胞在可渗透的聚酯膜（直径6.5 mm）上培养，接种密度为每孔50,000个细胞。（a）标尺=100 μm。在Transwell上培养的细胞经细胞角蛋白-FITC（绿色）和DAPI（蓝色）免疫荧光染色显示，这些细胞主要为上皮细胞，标尺=20 μm。细胞在培养基中完全浸没培养10天后，再仅从底部添加培养基继续培养4–6周，以形成气液界面（ALI），直至长出纤毛，如（b）所示，放大倍数为160×。纤毛摆动的视频见补充视频2。（c）透射电镜（TEM）图像显示ALI培养6周时的纤毛生长情况，放大倍数=150,000×。

图7 基于形态学特征应被弃用的细胞示例。当组织被多次移植后，通常会出现此类细胞。请注意，细胞和移植组织均应弃用。a) 细胞取自一个已培养6次的移植组织培养板，并接种于T75培养瓶中。一周内，细胞呈现出明显不同于上皮细胞铺路石样形态的特征，转而出现大量密集生长的细长形细胞。b) 更多不应与典型上皮细胞混合收集而应弃用的细胞示例。标尺=100μm。

表1：人支气管上皮细胞培养的特征

成功率（组织数量）	8/9（88.8%）
至第一代培养的中位时间（范围）（周）	4（3–5）
第一代培养时的平均细胞数（标准误）	15.1（2.75）×106
第一代培养时的平均存活率（标准误）	99%（2%）
（P1 = 第一次传代）

补充材料1 显示了从用于移植的人支气管节段刷取的一条带有纤毛和无纤毛的支气管上皮细胞，放大倍数为320X。点击此处查看补充材料1视频。

补充材料2 在气液界面培养的分化支气管上皮细胞。视频（2a和2b）分别显示纤毛摆动，放大倍数为160倍和320倍。点击此处观看补充材料2A视频。 点击此处观看补充材料2B视频。

讨论

本研究中，我们介绍了原代人支气管上皮细胞培养与扩增的详细方法。我们展示了如何将支气管组织的外植体和移植组织在促进上皮细胞生长的培养基中进行培养，从而持续获得人呼吸道上皮细胞，用于未分化（浸没式）和分化（气液界面培养）细胞模型的研究。这些细胞可用于更接近细胞真实生理环境的药物测试系统。非常重要的一点是，必须密切观察从外植体/移植组织中生长出的细胞，并确认其呈铺路石样形态。如果细胞形态不同，则应丢弃该批细胞及相应的外植体/移植组织，仅继续移植成功的组织。在我们的实验条件下，气液界面（ALI）培养的建立时间比先前报道的更长²。每隔一天更换一次气液界面的培养基，可能有助于促进上皮细胞更快地分化以及纤毛的生长。

我们希望本文所述方法能够鼓励您从组织外植体培养人支气管上皮细胞，并将这些细胞应用于您的研究体系中。毕竟，基于人源细胞的研究对于阐明人类肺部疾病机制中的重要通路以及基于细胞的 体外 针对人类细胞的毒性和功效筛选，以实现新药的早期评估并提高成功率。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白，粉末状	Sigma-Aldrich	A4919	用作包被溶液
I型胶原蛋白 0.1% 溶液 经无菌过滤	Sigma-Aldrich	C8919	用作包被溶液
人血浆来源的纤连蛋白	Sigma-Aldrich	F2006	用作包被溶液
厄尔’Earle's 平衡盐溶液（EBSS，无菌）	Sigma-Aldrich	28888	用于组织冲洗及包被溶液
DMEM/Ham F-12	Sigma-Aldrich	D8437
FBS	Sigma-Aldrich	F1015	灭活后，分装并冷冻（-20℃）°C）；必要时使用新鲜的
抗生素-抗真菌剂稳定液	Sigma-Aldrich	A5955	分装至2 ml样品瓶中，冷冻（-20℃）°C）；根据需要使用新鲜的
牛血清白蛋白溶液	Sigma-Aldrich	A8412	BSA
牛垂体提取物	Sigma-Aldrich	P1476	BPE
表皮生长因子	Sigma-Aldrich	E9644	EGF
(±)-肾上腺素	Sigma-Aldrich	E1635
胰岛素	Sigma-Aldrich	I6634
转铁蛋白 人	Sigma-Aldrich	T8158
三碘-L-甲状腺原氨酸	Sigma-Aldrich	T6397
氢化可的松	Sigma-Aldrich	H0888
视黄酸	Sigma-Aldrich	R2625
胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	T9935
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758	EDTA
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	P5368	PBS
70% 乙醇			用于消毒和清洁
24孔Transwell	康宁	3470
Corning 细胞培养瓶（T75）CLLBND	Fisher Scientific	05-539-104	这些培养瓶具有促进细胞贴附和生长的Cell Bind涂层
广谱细胞角蛋白单克隆抗体，FITC标记	Sigma-Aldrich	F3418	透化：0.2% TRITON X-100/PBS；使用1:250稀释度
抗体：E-钙黏蛋白（H108）	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-7870	<强>不要进行透化处理； 使用1:250稀释比例，以A21207（Invitrogen）作为二抗
Alexa Fluor 594 驴抗兔 IgG	Invitrogen	A21207	使用1:400稀释度
抗体：单克隆小鼠抗- α-平滑肌肌动蛋白-Cy3	Sigma-Aldrich	C6198	透化：0.2% TRITON X-100/PBS；使用1:100稀释度
抗体：波形蛋白（RV202）	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	Sc-32322	透化：0.2% TRITON X-100/PBS；使用1:100稀释比例，以T2402（Sigma-Aldrich）作为二抗
兔抗小鼠TRITC	Sigma-Aldrich	T2402	使用1:400稀释度
抗体：CD31 或 PECAM-1（M-20）	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	Sc-1506	<强>不要进行透化处理； 使用1:200稀释的驴抗山羊IgG-FITC作为二抗
驴抗山羊IgG-FITC	Santa Cruz Biotechnology, Inc.		使用1:100稀释度
含DAPI的Vectashield封片剂	Vector Laboratories	H-1200	避光冷藏；可标记细胞核，并在长期储存期间保持荧光
Vectashield 封片剂	Vector Laboratories	H-1000	避光冷藏；长期储存期间可保持荧光活性
H–chst 染色液	Sigma-Aldrich	H6024	染色细胞核；使用1:10稀释比例，并用Vectashield H-1000封片
<强>其他要求： 培养箱、生物安全柜（BSC）、离心机、100 mm 培养皿、无菌离心管（15 ml、50 ml 和 2 ml）、无菌移液器吸头、手术刀柄及刀片、小型锐利剪刀、实验服和手套。上述物品可从您常用的供应商处采购。