人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的分离

摘要

本视频方案演示了从人脐带中分离和培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的方法。分离后的细胞可用于体外血管生成实验，例如 Hughes 实验室所展示的优化纤维蛋白凝胶微珠实验。

摘要

血管生成是一个复杂的多步骤过程，在血管生成刺激因子的作用下，由现有脉管系统形成新的血管。这些步骤包括：基底膜降解、内皮细胞（EC）增殖和迁移（出芽）进入细胞外基质、内皮细胞排列成索状结构、管腔形成、血管吻合以及新基底膜的形成。目前已开发出多种体外检测方法用于研究这一过程，但大多数方法仅能模拟血管生成的某些阶段，且在形态学上形成的血管往往与体内血管存在差异。本文展示了一种优化的体外血管生成检测方法，该方法利用人脐静脉内皮细胞（EC）和成纤维细胞。该模型可重现血管生成的所有关键早期阶段，尤为重要的是，所形成的血管具有由极化内皮细胞包绕的通畅细胞间管腔。这些血管可通过相差显微镜和延时显微镜轻松观察，并可被纯化回收用于后续应用。

方案

实验步骤

1. 将脐带置于洁净垫上，轻拍去除多余血液。在脐带两端做新鲜切口。
2. 插入21½ G针头 保留塑料针套，将针插入静脉。（静脉是最大的开口；另外两个较小的为动脉）
3. 夹紧针头 用止血钳固定，并将装有Hanks液的20 cc注射器连接到针头上。
4. 将Hanks缓冲液推过 用中等压力冲洗血管。将废液收集到含漂白剂的烧杯中。（一只手握住针头和导管，另一只手推进，可防止针头脱出血管。）如果血管内血液较多，需再次冲洗。
5. 将导管置于垫上，夹住静脉的另一端。用几毫升 Hanks 液灌注 检查泄漏 沿导管回抽5 mL血液，然后松开底部夹子。
6. 断开20 cc注射器，从10 cc注射器中取出活塞，将10 cc注射器连接到针头。 加入10 ml胶原酶 并替换推杆。将胶原酶推入静脉，直至看到少量液体从开口端流出。重新夹闭开口端，并继续注入胶原酶，直至充满 静脉中度扩张过度扩张会导致平滑肌污染。
7. 轻轻按摩脐带.
8. 将脐带（附有止血钳、针头和注射器）在37°C的DPBS中孵育15分钟。
9. 孵育期间，继续对2进行步骤1-8^nd 脊索
10. 孵育结束后，将脐带从烧杯中取出，同时将脐带悬于50 mL离心管上方，剪去末端 上方 底部夹具 务必确保将所有物质收集到离心管中将剩余的胶原酶推过脐带，然后连接20 mL注射器，以适中压力推入Hanks液。
11. 若不需要平滑肌细胞，此时可弃去组织块；否则，将同一组织块放入含约5 ml胶原酶的第二个50 ml离心管中，于37°C孵育30–60分钟。
12. 将试管保留，直至所有脐带处理完毕。
13. 离心管 在约1200 rpm下离心5分钟。
14. 吸弃上清液（保留约1-2 mL）。 重悬 将沉淀重悬于5 ml PHEC+中，并接种至T25培养瓶中。
15. 37°C孵育 含5% CO₂ 过夜。
16. 次日去除上清液，更换新鲜培养基。若红细胞较多，用M199洗涤一次，然后加入PHEC+。继续常规培养，直至培养板细胞融合（1–4天）。将细胞传代至经明胶包被的T75培养瓶中。
17. T75 培养瓶长满后，按 1:3 传代。每瓶冻存两管。

注意：内皮细胞（未活化状态）呈鹅卵石样形态。内皮细胞在分离后有时会立即进入活化状态（细长且尖端突出），经过几次传代后通常会恢复为未活化状态。

清理

1. 非常小心地将针头丢弃至锐器容器中。
2. 将注射器丢弃至大型生物危害容器中。
3. 将所有组织放入小型生物危害袋中。封好袋子 ，并在 -20°C 冷冻，直至焚烧处理。
4. 将所有器械浸泡于杀病毒剂中至少 10 分钟。
5. 将培养基加入废液/漂白剂烧杯中，静置至少 10 分钟。
6. 将实验台垫板丢弃至生物危害废物容器中。
7. 用杀病毒剂喷洒烧杯内外表面、实验台面以及水浴锅盖，静置 10 分钟后擦拭干净。
8. 用温水冲洗烧杯和器械，并悬挂在架子上晾干（用纸巾擦干器械，防止生锈）。
9. 将已去污染的废弃物倒入水槽中处理。
10. 将未使用的培养基放回冰箱。
11. 将手套丢弃至生物危害废物容器中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1% 胶原酶			每根脐带使用 10 mL，预热至 37 °C
组织培养瓶			T75，每根脐带使用一个。
汉克氏培养基
剪刀			无菌
烧杯			无菌
50 mL 离心管