多电极阵列（MEA）记录技术为研究大量神经元群体的电活动提供了一种方法。本文中，我们介绍了在同时刺激组织的条件下，从小鼠副嗅上皮进行记录的多电极阵列制备的详细步骤。
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本文内容
摘要
摘要
理解神经回路需要能够同时记录多个神经元活动的方法。in vitro研究中，目前可用的一种技术是平面多电极阵列（MEA）记录。本文记录了使用MEA研究小鼠副嗅器官（VNO）的方法，VNO通过表达数百种不同类型受体的多种感觉神经元，在信息素和社会线索的检测中发挥关键作用。将MEA记录与机器人液体处理系统结合以递送化学刺激物，可记录大量且多样化神经元群体的感觉反应。该制备方法使我们能够从小鼠中完整取出VNO的感觉上皮组织，并在数小时内使用一系列化学物质或潜在配体进行刺激，同时监测神经元的电活动。因此，该技术为评估配体活性以及探索受体神经元的特性提供了一种有效的方法。本文介绍了制备副嗅上皮组织、MEA记录及化学刺激所需的技术步骤。
方案
第1部分. 电生理记录仪器
- 我们使用一种平面多电极阵列（ALA Scientific Instruments），其电极为10 μm的平面氮化钛电极，以氮化硅绝缘。60个电极被排列成两个区域，每个区域为5×6网格，电极中心间距为30 μm。（也可采用其他配置；直径为10 μm的记录表面电极在分离单个神经元活动方面优于更大的电极。）
- 电信号通过MEA 1060放大器（ALA Scientific Instruments）进行放大（放大倍数为1000倍）。信号由数据采集卡（National Instruments）和自定义数据采集软件以10 kHz的频率采集（也可购买商用软件）。
- 组织由一块尼龙网（53 μm）固定在MEA上，该尼龙网连接在一个定制的插入件上，该插入件可紧密地嵌入MEA的培养管环内。
第二部分. 液体输送仪器
- 组织需要持续灌流，我们通过高效液相色谱泵（HPLC泵）供给林格氏液（115 mM 氯化钠、5 mM 氯化钾、2 mM 氯化钙、2 mM 氯化镁、25 mM 碳酸氢钠、10 mM HEPES 和 10 mM D-(+)-葡萄糖）来保证这一点。刺激物通过将样品注入HPLC阀并切换流通路径与环路来施加。HPLC泵和注射机器人中的注射泵均使用林格氏液供给。
- 实验全程将林格氏液置于恒温水浴（ISOTEMP 105）中，温度维持在42°C，并持续用95% O2 / 5% CO2混合气体鼓泡。另准备一份不含葡萄糖的林格氏液，用于填充注射泵。使用307型HPLC泵（Gilson）以3 mL/min的流速将林格氏液输送至组织。在典型的5至6小时实验中，每种林格氏液各需1 L即足够。
- 实验过程中，组织始终以37°C的林格氏液进行持续灌流。加热探头直接置于组织上方。
- 刺激物通过Gilson 215液体处理机器人臂递送。刺激物储存于带橡胶盖的玻璃小瓶中，在Gilson软件控制下，机器人臂将刺激物加入灌流管路，同时保持恒定的流速和压力。
- HPLC阀的状态（环路接入/未接入）以电信号电压表示，并由数据采集计算机作为额外通道记录，以确保与神经元活动的同步性。
第3部分. 准备MEA和刺激递送装置
- 进行解剖前，将牛血清白蛋白（BSA）溶于去离子水（dH2O）中，室温孵育MEA孔至少5分钟。
- 使用预热并通入气泡的林格氏液冲洗MEA，然后将MEA置于冰上。
- 根据制造商说明书对液体处理仪和高效液相色谱（HPLC）泵进行预处理。
第4部分. VNO解剖
- 在进行解剖前，将两皿60×15 mm的培养皿中加入充氧的任氏液，并置于冰上。另取两个相同大小的硅胶包被培养皿，加入任氏液后也置于冰上。额外准备50 mL温热并充氧的任氏液，冷藏备用，用于解剖过程中。
- 小鼠通过 CO2 窒息后颈椎脱位。
- 从口角两侧开始，沿下颌线平行向头后部做双侧切口。在颈背部将两切口连接，去除头部背侧部分，保留下颌与小鼠相连。
- 使用精细剪刀，在组织与上颌骨两侧之间进行剪切，以分离组织与骨骼。
- 使用#3镊子剥离腭部组织，以暴露鼻腔。
- 使用小剪刀或手术刀，在上排两颗门牙之间及其两侧进行切割，以将犁鼻器囊从骨头上分离下来。
- 使用#3镊子夹住犁鼻器囊的扁平骨部分，并置于冰上的培养皿中。从开始操作至浸入为止的步骤应在3分钟内完成。
- 将培养皿置于体视显微镜下，使用反射光照明。用#3镊子逐个去除犁鼻器的骨性囊。一手用镊子从尾端固定骨性囊，另一手将骨组织从犁鼻器上剥离，注意避免损伤犁鼻器。
- 当去除骨骼后，将犁鼻器转移至涂有Sylgard的培养皿中。使用另一个培养皿放置另一侧犁鼻器。切换照明至透射光。
- 使用显微剪刀或5号镊子，沿犁鼻器边缘将其与血管分离。此时，神经上皮将完全与血管分离。
- 将犁鼻器（VNO）置于内侧（树突侧）朝上的位置。使用#3镊子将VNO的一角固定在Sylgard上。用钳子夹住一小片聚四氟乙烯涂层剃须刀片，以浅角度持刀，从基底膜上剥离神经上皮。< 30° 从培养皿表面剥离）效果最佳。
- 使用玻璃移液管将神经上皮组织从培养皿转移至MEA。将犁鼻器置于电极阵列区域上方，确保树突侧朝上。用移液管吸除多余的林格氏液。将网状组织固定器放入阵列孔中以固定犁鼻器，并加入冷的林格氏液。
第5部分. 记录
- 将MEA放置在MEA 1060放大器中，并将加热探针置于组织正上方。
- 为确认加热探针位置正确，使用含50 mM钾离子（等摩尔替代钠离子）的任氏液刺激组织2秒。调整探针位置，以最小化组织对高钾溶液刺激的神经反应潜伏期。
- 在记录前，用预热的任氏液对组织进行45分钟至1小时的灌流，使其充分适应环境。
- 使用定制记录软件将电信号保存至磁盘。
第6部分. 数据分析
- 可以使用原始电极记录数据进行离线数据分析。例如，我们测量记录到的细胞在特定配体刺激下放电频率的变化。所得数据集规模较大，可用于回答多种不同的科学问题；因此需要掌握某种编程或数据分析语言（如 C、Matlab、R、Python 或类似语言）。
第7部分. 代表性结果
该制备通常足够稳定，可进行长达6小时的记录，产生大量数据（60个电极记录6小时）。
图1. 显示了阵列一半区域上同时记录的活动快照。时间窗口跨度为400 ms。请点击此处查看图1的放大版本。
图2. 在典型的实验中，我们使用特定感兴趣的化合物进行10秒的刺激。该曲线是响应100倍稀释的雌性小鼠尿液的一个示例。请点击此处查看图2的放大版本。
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讨论
多电极阵列记录技术使我们能够同时监测大量神经元群体的活动。该技术是研究感觉系统特性的有力工具，特别是犁鼻器（VNO）。与主嗅觉系统不同，犁鼻器检测的是液相中的刺激物。此外，犁鼻器是一种具有异质性的组织。小鼠犁鼻器中约有300种不同类型的受体1，推测具有不同的反应特征。结合机械臂的多电极阵列记录技术使我们能够可靠地向大量且多样化的神经元群体递送液体刺激，并通过电生理方法鉴定其反应。此外，VNO的稳定性 体外 为同一刺激的多次重复提供时间。
此前，该技术已被用于研究嗅觉神经元（VSNs）对小鼠尿液刺激的感知特性2，并作为可靠的方法用于鉴定尿液中存在的单个配体3。未来，该技术可能在进一步发现配体以及表征犁鼻器（VNO）的感知特性方面具有重要应用价值。
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致谢
我们感谢Holy实验室的成员。本工作由国家耳聋及其他沟通障碍研究所（R01 DC005964，授予T.E.H.）和美国国家科学基金会IGERT 0548890（H.A.A.）资助。
动物实验是根据美国动物福利法和美国国立卫生研究院指南进行的，并获得了华盛顿大学动物护理和使用委员会的批准。
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参考文献
- Dulac, C., Torelo, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat Rev Neurosci. 4, 551-562 (2003).
- Holy, T. E. Responses of Vomeronasal neurons to natural stimuli. Science. 289, 1569-1572 (2000).
- Nodari, F. Sulfated steroids as natural ligands of mouse pheromone-sensing neurons. J Neurosci. 28, 6407-6418 (2008).
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重印与许可
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