检测可扩散信号分子重定向胚胎脊髓联合轴突能力的实验方法

摘要

该实验用于评估信号分子（此处为骨形态发生蛋白7，BMP7）对联合轴突重新定向的能力。将胚胎背侧脊髓组织外植体与分泌候选生长因子的COS细胞聚集体相邻培养，通过免疫组织化学方法观察外植体内重新定向生长的联合轴突。

摘要

脊椎动物脊髓中的背侧连合轴突¹ 一直是鉴定轴突导向信号的宝贵模型系统。本文中，我们描述了一种 体外 检测，“重定向检测”，已被广泛用于研究外在和内在信号对连合轴突定向的影响²该实验由 Jane Dodd、Thomas Jessell 和 Andrew Lumsden 实验室的多位研究人员共同开发（详见致谢部分），该实验的不同版本曾被用于证明关键轴突导向分子的重定向作用，包括脊髓顶板中的 BMP 化学排斥分子^3,4 Netrin1的化学吸引活性⁵ 和 Sonic Hedgehog (Shh)⁶ 在脊髓的底板中。

从胚胎第11天（E11）大鼠的脊髓背侧三分之二区域切取包含2-3个节段的外植块，并将其培养于三维胶原凝胶中⁷E11 背侧脊髓外植体包含新生成的联合神经元，可通过其轴突表达的糖蛋白 Tag1 鉴定⁸在培养过程中，经过30-40小时，这些背侧外植体中联合轴突的走行路径得以重现，其时间进程与体内观察到的相似。 体内该轴突轨迹可通过将测试组织或表达候选信号分子的COS细胞团块置于背侧外植体的一侧边缘进行挑战。在附加组织附近延伸的联合轴突将在内源性顶板和异位侧组织信号的共同影响下生长。在这些条件下，联合轴突重新定向的程度可以被量化。利用该检测方法，既可检验特定信号分子对联合轴突重新定向的充分性^3,4 以及该信号引导联合通路走向的必要性⁹.

方案

第1部分：利用悬滴法制备转染COS细胞的聚集体

1. 在35 mm培养皿中接种COS-7（COS）细胞。当细胞达到80%融合度时，按照制造商的说明书，使用Lipofectamine2000将1 μg表达质粒转染入细胞中。
2. 为制备悬滴，吸除转染培养基，并用1 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗转染后的COS细胞。加入0.5 ml无酶细胞解离液，处理15分钟。随后加入1 ml Opti-MEM + 1×青霉素/链霉素/谷氨酰胺（P/S/G）+ 10%胎牛血清（FBS）溶液以终止反应。
3. 吹打细胞使其从培养皿表面脱落，并转移至15 ml锥形管中。在2000×g下离心2分钟以收集细胞沉淀。弃去上清液，将沉淀重悬于100 μl Opti-MEM + 1× P/S/G + 10% FBS中。
4. 在35 mm培养皿盖内表面滴加多个20 μl液滴，将皿盖倒置并放置于培养皿底部之上，置于37°C培养箱中数小时，直至细胞聚集成团。

第2部分：背侧脊髓外植体的制备

1. 从母鼠子宫中取出 E11 大鼠胚胎，并将其置于冰上的 L15 培养基中保存，待用。
2. 使用锋利的钨针，从每个胚胎躯干部分切取 4–6 个体节，取材区域位于前肢芽下方紧邻处。用塑料移液管将组织块收集至一个 4 孔 Nunc 培养皿的某一孔中，并置于冰上保存。
3. 当所有胚胎节段解....

讨论

决定本实验成功的关键因素有以下几点：首先，组织用dispase处理的时间不宜过长，否则会导致组织变得非常黏稠且细胞活力下降。其次，胶原蛋白必须充分预冷，并尽可能保持在冰上。一旦开始凝固（即变为粉红色），其操作难度将逐渐增加。第三，钨针必须始终保持非常锋利。

....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1型大鼠尾胶原	BD Biosciences	354236
COS-7细胞	ATCC	CRL-1651
10倍最低必需培养基	Invitrogen	11430-030
Opti-MEM	Invitrogen	51985-034
L15	Invitrogen	11415-064
Lipofectamine 2000	Invitrogen	1166-8019
胎牛血清	Mediatech, Inc.	35-016-CV
细胞解离液	EMD Millipore	S-004-C
0.25%胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	2520-0056
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S6297
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
青霉素/链霉素/谷氨酸盐	Invitrogen	10378-016
多聚甲醛	Baker/VWR	JTS898-7
Dispase	Roche Group	10241750001
小鼠抗Tag1 IgM单克隆抗体（4D7）	发育研究杂交瘤库
小鼠抗Myc IgG单克隆抗体（9E10）	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-40
FITC标记的山羊抗小鼠IgM抗体	Jackson	115-095-075
Cy3标记的山羊抗小鼠Fcy抗体	Jackson	115-165-071
山羊血清	Invitrogen	16210064
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
4孔Nunclon培养皿	Nalge Nunc international	62407-068
3孔凹玻片	VWR international	48339-009
48孔板	Falcon BD	62406-195
吸管装置组件	FHC, Inc.	30-32-0
#55 Dumont镊子	Fine Science Tools	11252-20
#5 Dumont镊子	Fine Science Tools	11255-20
持针器	Fine Science Tools	26016-12