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检测可扩散信号分子重定向胚胎脊髓联合轴突能力的实验方法

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DOI：

10.3791/1853

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2010年3月8日

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1Department of Biological Sciences, University of Southern California, 2Neuroscience Graduate Program, University of Southern California

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

该实验用于评估信号分子（此处为骨形态发生蛋白7，BMP7）对联合轴突重新定向的能力。将胚胎背侧脊髓组织外植体与分泌候选生长因子的COS细胞聚集体相邻培养，通过免疫组织化学方法观察外植体内重新定向生长的联合轴突。

摘要

脊椎动物脊髓中的背侧连合轴突1 一直是鉴定轴突导向信号的宝贵模型系统。本文中，我们描述了一种 体外 检测，“重定向检测”，已被广泛用于研究外在和内在信号对连合轴突定向的影响2该实验由 Jane Dodd、Thomas Jessell 和 Andrew Lumsden 实验室的多位研究人员共同开发（详见致谢部分），该实验的不同版本曾被用于证明关键轴突导向分子的重定向作用，包括脊髓顶板中的 BMP 化学排斥分子3,4 Netrin1的化学吸引活性5 和 Sonic Hedgehog (Shh)6 在脊髓的底板中。

从胚胎第11天（E11）大鼠的脊髓背侧三分之二区域切取包含2-3个节段的外植块，并将其培养于三维胶原凝胶中7E11 背侧脊髓外植体包含新生成的联合神经元，可通过其轴突表达的糖蛋白 Tag1 鉴定8在培养过程中，经过30-40小时，这些背侧外植体中联合轴突的走行路径得以重现，其时间进程与体内观察到的相似。 体内该轴突轨迹可通过将测试组织或表达候选信号分子的COS细胞团块置于背侧外植体的一侧边缘进行挑战。在附加组织附近延伸的联合轴突将在内源性顶板和异位侧组织信号的共同影响下生长。在这些条件下，联合轴突重新定向的程度可以被量化。利用该检测方法，既可检验特定信号分子对联合轴突重新定向的充分性3,4 以及该信号引导联合通路走向的必要性9.

方案

第1部分：利用悬滴法制备转染COS细胞的聚集体

  1. 在35 mm培养皿中接种COS-7（COS）细胞。当细胞达到80%融合度时，按照制造商的说明书，使用Lipofectamine2000将1 μg表达质粒转染入细胞中。
  2. 为制备悬滴，吸除转染培养基，并用1 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗转染后的COS细胞。加入0.5 ml无酶细胞解离液，处理15分钟。随后加入1 ml Opti-MEM + 1×青霉素/链霉素/谷氨酰胺（P/S/G）+ 10%胎牛血清（FBS）溶液以终止反应。
  3. 吹打细胞使其从培养皿表面脱落，并转移至15 ml锥形管中。在2000×g下离心2分钟以收集细胞沉淀。弃去上清液，将沉淀重悬于100 μl Opti-MEM + 1× P/S/G + 10% FBS中。
  4. 在35 mm培养皿盖内表面滴加多个20 μl液滴，将皿盖倒置并放置于培养皿底部之上，置于37°C培养箱中数小时，直至细胞聚集成团。

第2部分：背侧脊髓外植体的制备

  1. 从母鼠子宫中取出 E11 大鼠胚胎，并将其置于冰上的 L15 培养基中保存，待用。
  2. 使用锋利的钨针，从每个胚胎躯干部分切取 4–6 个体节，取材区域位于前肢芽下方紧邻处。用塑料移液管将组织块收集至一个 4 孔 Nunc 培养皿的某一孔中，并置于冰上保存。
  3. 当所有胚胎节段解剖完成后，用塑料移液管将组织块转移至另一孔中，该孔含有 1 ml L15 培养基加 1 mg 分散酶的溶液。室温孵育不超过 5 分钟。切勿使组织块在分散酶中过度孵育。
  4. 在孵育期间，将 0.5 ml 热灭活的正常山羊血清（HIGS）加入约 10 ml L15 培养基中，置于培养皿内轻轻混匀。取 1 ml 该溶液加入 Nunc 培养皿的第三孔中，孵育结束后将组织块转移至此溶液中，然后置于冰上。注意：若允许组织块在冰上“静置”约 1 小时，后续解剖操作将更为容易。

第3部分：胶原蛋白的启动

  1. 向360μl胶原蛋白中加入40μl 10倍浓缩的最低必需培养基，通过轻弹管壁或短暂涡旋迅速且充分混匀。在微量离心机中快速离心。溶液将呈黄色。尽可能保持在冰上操作。
  2. 加入适量0.8M碳酸氢钠（NaHCO3），使胶原蛋白溶液略呈橙色（见下文注释）。再次通过轻弹管壁迅速且充分混匀，并在微量离心机中短暂离心。若混匀后溶液仍为粉红色，则表明NaHCO3添加过量，需更换新的胶原蛋白重新开始。
  3. 此时胶原蛋白溶液已准备就绪。在冰上可保持液态，但当温度升至室温时，约5分钟内会凝固（变为粉红色）。
  4. 在4孔Nunc培养皿的每个孔中加入20μl胶原蛋白。用移液器枪头将胶原蛋白铺展成一个小“垫”状。于室温下静置，使胶原蛋白凝固。

注意：每批胶原蛋白所需的 NaHCO3 确切用量需进行滴定。起始用量宜低（11 μl），然后以 0.5–1 μl 的增量逐步添加，直至溶液呈现微橙色。合适的用量通常比使胶原蛋白变为粉红色所需的最少 NaHCO3 量少 1 μl。NaHCO3 的用量与胶原蛋白量之间不存在线性比例关系。

第4部分：背侧脊髓外植体的分离及其在胶原基质中与COS细胞团的定位

  1. 使用新磨制的钨针和精细镊子（#5 或 #55），去除脊髓周围的中胚层组织。
  2. 用钨针平行于底板进行切割，小心地去除脊髓腹侧五分之一部分。
  3. 将背侧脊髓外植体沿中线切为两半，确保切缘尽可能整齐；如有必要，可重新修整边缘。使用连接玻璃毛细管（拉制至直径约 0.5 mm）的口吸管，将每个背侧脊髓外植体分别转移至独立的胶原垫上。
  4. 将转染的 COS 细胞聚集体切成与背侧脊髓外植体侧缘宽度大致相同的方块。
  5. 使用口吸管将其中一个方块转移至含有背侧脊髓外植体的胶原垫上。
  6. 用口吸管吸除多余液体，注意不要过度吸取。
  7. 在胶原垫上加入 4 μl 预凝胶化的胶原液，并使用钨针轻轻推动胶原覆盖外植体，避免直接接触组织。通过在外植体周围的胶原中移动钨针，调整外植体位置，使 COS 细胞聚集体紧邻背侧脊髓外植体的侧缘。
  8. 待胶原凝固后，再次加入 4 μl 胶原液，以确保外植体完全被胶原包裹。
  9. 在组织培养超净台内加入 0.5 ml Opti-MEM + 1×P/S/G，培养 30–40 小时。
  10. 将外植体置于冰上，加入 0.5 ml 含 4% 多聚甲醛的 1×PBS 溶液，固定 45 分钟。
  11. 用封闭液（PBTN：1×PBS + 0.1% Triton-X100 + 1% HIGS）清洗两次，每次 0.5 ml；在 4°C 下封闭至少数小时，建议过夜孵育，随后进行免疫组织化学处理。

第5部分：通过免疫组织化学法可视化连合轴突

  1. 在PBTN中封闭后，用镊子将外植体从4孔板中取出，并置于48孔板中。
  2. 向每孔加入200μl一抗，4°C下孵育过夜。为观察联合轴突，使用1:6稀释的小鼠抗Tag1抗体。为确定转染是否成功，还需加入针对待测信号分子的一抗，或当信号分子带有表位标签时，使用针对相应表位的一抗。
  3. 在4°C下，用PBTN对每个样本洗涤5次，每次1小时。
  4. 向每孔加入200μl二抗，4°C下孵育过夜。若一抗为抗Tag1抗体，则使用与FITC或Cy3偶联的山羊抗小鼠IgM二抗。 若使用对光敏感的FITC或Cy3偶联二抗，从此时起需用铝箔包裹48孔板以避光。
  5. 在4°C下，用PBTN对每个样本洗涤5次，每次1小时。
  6. 将外植体转移至3孔凹面载玻片，吸去多余液体，用Vectashield封片剂封片。置于避光盒中，于4°C或-20°C保存。

第6部分：外植体的代表性图像

在成功的实验中，外植体与COS团块应保持相互紧邻，且在胶原凝固过程中不会发生分离。轴突的过度生长应极少；若出现明显的轴突过度生长，则表明背侧脊髓外植体培养时间过长。外植体不应出现泡状突起；若组织直接接触培养基，则会发生起泡现象。

使用共聚焦显微镜评估信号分子重新定向轴突的能力。可通过测量最靠近COS细胞聚集体的轴突的平均重新定向角度来量化轴突重新定向的程度3。如图1所示，表达myc标签BMP7（蓝色）的COS细胞可使Tag1+联合轴突（绿色）偏离BMP7来源方向（图1B），其方式类似于顶板组织块对联合轴突的排斥作用（图1A）。表达对照载体的COS细胞对联合轴突的走向无影响3,4。这些组织块还用针对转录因子Isl1/2（红色）的抗体进行标记，该抗体可标记运动神经元和背侧中间神经元。该结果首次表明，BMP家族成员介导了顶板化学排斥因子的活性3。

神经外植体示意图；Tag1、Isl1/2、Myc 表达；COS 细胞，BMP7 效应分析。
图 1： 请点击此处查看图 1 的放大版本。

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讨论

决定本实验成功的关键因素有以下几点：首先，组织用dispase处理的时间不宜过长，否则会导致组织变得非常黏稠且细胞活力下降。其次，胶原蛋白必须充分预冷，并尽可能保持在冰上。一旦开始凝固（即变为粉红色），其操作难度将逐渐增加。第三，钨针必须始终保持非常锋利。

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致谢

该方案由 Jane Dodd、Thomas Jessell 和 Andrew Lumsden 的实验室开发。包括 Konrad Basler、Ann Calof、Thomas Edlund、Phil Hamilton、Domna Karagogeos、Ariel Ruiz i Altaba 和 Toshiya Yamada 在内的许多研究人员确定了在胶原中培养脊髓外植体的方法。Marysia Placzek 和 Marc Tessier-Lavigne 率先采用体外外植体中轴突生长的技术，用于鉴定轴突导向分子。Butler 实验室的工作得到了美国出生缺陷基金会（March of Dimes）以及美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH/NINDS）R01 NS063999 项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1型大鼠尾胶原BD Biosciences354236
COS-7细胞ATCCCRL-1651
10倍最低必需培养基Invitrogen11430-030
Opti-MEMInvitrogen51985-034
L15Invitrogen11415-064
Lipofectamine 2000Invitrogen1166-8019
胎牛血清Mediatech, Inc.35-016-CV
细胞解离液EMD MilliporeS-004-C
0.25%胰蛋白酶-EDTAInvitrogen2520-0056
碳酸氢钠Sigma-AldrichS6297
Triton X-100Sigma-AldrichX100
青霉素/链霉素/谷氨酸盐Invitrogen10378-016
多聚甲醛Baker/VWRJTS898-7
DispaseRoche Group10241750001
小鼠抗Tag1 IgM单克隆抗体（4D7）发育研究杂交瘤库
小鼠抗Myc IgG单克隆抗体（9E10）Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-40
FITC标记的山羊抗小鼠IgM抗体Jackson115-095-075
Cy3标记的山羊抗小鼠Fcy抗体Jackson115-165-071
山羊血清Invitrogen16210064
VectashieldVector LaboratoriesH-1000
4孔Nunclon培养皿Nalge Nunc international62407-068
3孔凹玻片VWR international48339-009
48孔板Falcon BD62406-195
吸管装置组件FHC, Inc.30-32-0
#55 Dumont镊子Fine Science Tools11252-20
#5 Dumont镊子Fine Science Tools11255-20
持针器Fine Science Tools26016-12

参考文献

  1. Altman, J., Bayer, S. A. The development of the rat spinal cord. , (1984).
  2. Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. Methods in molecular biology. , Springer. Clifton, N.J. 461 vol 325-335 (2008).
  3. Augsburger, A., Schuchardt, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24, 127-141 (1999).
  4. Butler, S. J., Dodd, J. A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons. Neuron. 38, 389-401 (2003).
  5. Kennedy, T. E., Serafini, T. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78, 425-435 (1994).
  6. Charron, F., Stein, E. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. 113, 11-23 (2003).
  7. Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
  8. Dodd, J., Morton, S. B. Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons. Neuron. 1, 105-116 (1988).
  9. Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions. Development. 135, 1119-1128 (2008).

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COS BMP7 Tag1

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