鉴定酵母中表达细菌III型效应蛋白所诱导的生长抑制表型

摘要

在本视频中，我们介绍了一种在酵母中表达细菌III型效应子并鉴定效应子诱导的生长抑制表型的方法。此类表型可进一步用于阐明效应子的功能及其作用靶点。

摘要

许多革兰氏阴性致病菌利用III型分泌系统将一系列效应蛋白转运至宿主细胞的细胞质中。在细胞内，III型效应蛋白通过干扰宿主细胞的正常生理过程，抑制免疫反应并促进病原体的增殖。迄今为止，已鉴定出多种植物和动物细菌病原体的III型效应蛋白，但其中仅有少数被深入表征。由于特定细菌菌株的效应蛋白组存在功能冗余、效应蛋白对毒力的提升作用较为细微、其功能可能仅在特定感染阶段发挥作用，以及某些病原体在遗传操作上的困难，导致对这些效应蛋白功能的研究受到限制。在出芽酵母中表达III型效应蛋白Saccharomyces cerevisiae可能有助于克服这些限制，并促进对效应蛋白的功能表征。由于III型效应蛋白通常靶向酵母与其他真核生物之间保守的细胞过程，其在酵母中的表达可能导致生长抑制表型，从而可用于阐明效应蛋白的功能与靶标。利用酵母进行细菌效应蛋白功能研究的其他优势还包括：遗传操作简便、绝大多数开放阅读框（ORFs）的预测功能信息已知，以及可用于全基因组和小规模实验的多种工具与资源丰富。本文讨论了设计用于表达细菌III型效应蛋白的酵母系统时需考虑的关键因素，包括驱动目标效应基因表达的合适启动子、效应基因的拷贝数、用于验证蛋白表达的表位标签以及酵母菌株。我们提供了在酵母中诱导效应蛋白表达并通过免疫印迹验证其表达的实验方案。此外，我们还描述了一种在琼脂平板上的点样实验，用于鉴定效应蛋白诱导的生长抑制表型。本实验方案的应用可扩展至研究任何病原体通过特定转运机制递送至宿主细胞内的致病因子。

方案

I. 设计用于III型效应蛋白的酵母表达系统

校准适用于表达目标III型效应子的酵母系统是一项重要工作，可能需要经过多次尝试和优化。在设计此类系统时，应考虑并优化以下几个关键因素：1）驱动效应子表达的启动子，2）效应子基因的拷贝数，3）用于验证蛋白质表达的表位标签，以及4）酵母菌株。

1) 启动子

由于细菌III型效应子可能对酵母细胞具有毒性，因此应使用可诱导启动子来控制其表达。GAL1启动子常用于此目的，其活性受培养基中碳源的调控：葡萄糖可抑制其表达，而半乳糖可诱导其表达。然而，有报道称该启动子在抑制条件下存在轻微的渗漏表达，导致不期望的毒性。若遇到类似问题，建议按如下所述降低效应子基因的拷贝数，或使用其他可诱导启动子，例如MET3或CUP1启动子¹。本文描述了利用半乳糖可诱导启动子表达效应蛋白的操作步骤。

2) 基因拷贝数

影响蛋白表达水平的另一个参数是细胞内效应基因的拷贝数。当效应基因由2微米质粒携带时（每细胞40-60拷贝），可实现高水平表达；使用含着丝粒的质粒（每细胞1-3拷贝）可获得中等水平表达；而当效应基因通过同源重组整合到酵母基因组中时，则实现低水平表达。通过结合含着丝粒的载体与GAL1启动子，我们已成功表达了约50种植物病原菌Xanthomonas campestris pv. vesicatoria和Pseudomonas syringae pv. tomato的效应蛋白，其表达水平可通过免疫印迹分析检测，并且在抑制条件下泄漏表达极低（Salomon和Sessa，未发表）。

3) 表位标签

如果缺乏针对目标效应蛋白的抗体，可将表位标签与效应蛋白融合，以便通过免疫印迹检测其表达。常用的标签包括 Myc、血凝素（HA）和 Flag，这些标签均有可靠的商业化抗体可供使用。建议仅使用一个标签拷贝，以尽量减少对效应蛋白结构和活性产生不良影响。

4）酵母菌株

用于表达的酵母菌株必须具备对表达载体选择标记的营养缺陷型这一基本要求。需要注意的是，不同的酵母菌株可能对某些效应因子的表达表现出不同的敏感性。例如，我们观察到BY4741和W303菌株对多种野油菜黄单胞菌辣椒致病变种（Xanthomonas campestris pv. vesicatoria）效应因子的敏感性存在差异（Salomon和Sessa，未发表数据）。因此，最好在不同的酵母菌株中测试目标效应因子。

二、酵母培养基的制备

对于不含任何载体的酵母菌株的培养，使用YPD培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨和2% [w/v]葡萄糖）作为生长培养基。对于固体培养基，向溶液中加入2% [w/v]琼脂（如果固体培养基过于柔软，可在灭菌前向培养基中添加0.05% [v/v]的5 N NaOH储备溶液）。我们建议在最终体积的90%中配制不含葡萄糖的培养基并进行高压灭菌。使用前，用过滤除菌的20% [w/v]葡萄糖溶液补足至100%体积（将20%葡萄糖溶液保存在4°C以防止污染）。

对于含有提供可选择标记物（亮氨酸、尿嘧啶、组氨酸或色氨酸）原养型载体的酵母菌株的培养，使用不含亮氨酸、尿嘧啶、组氨酸和色氨酸的合成缺失培养基（6.7 g/L 无氨基酸酵母氮源基础培养基，1.4 g/L 酵母合成缺失培养基补充剂），并添加 2% [w/v] 葡萄糖，或 2% [w/v] 半乳糖和 1% [w/v] 棉子糖。对于固体培养基，向溶液中加入 2% [w/v] 琼脂。建议将培养基配制为最终体积的 90%，并进行高压灭菌。在使用前，用滤膜除菌的 20% 葡萄糖溶液，或滤膜除菌的 20% 半乳糖 + 10% 棉子糖溶液补足至 100% 体积，具体取决于所需碳源（将 20% 葡萄糖溶液以及 20% 半乳糖 + 10% 棉子糖溶液置于 4°C 保存以防止污染）。根据表达载体的可选择标记物，在使用前添加其他氨基酸或尿嘧啶（每升培养基加入 10 ml 亮氨酸储备液 [1 g/100 ml]，或 10 ml 尿嘧啶储备液 [200 mg/100 ml]，或 2 ml 组氨酸储备液 [1 g/100 ml]，或 2 ml 色氨酸储备液 [1 g/100 ml]）。配制亮氨酸和尿嘧啶储备液时，通过高压灭菌进行灭菌，并在室温下保存。配制组氨酸和色氨酸储备液时，通过过滤灭菌，用铝箔包裹瓶体以避光，并在 4°C 下保存。在下述实验步骤中，添加了亮氨酸、尿嘧啶、组氨酸和色氨酸的合成缺失培养基称为合成完全培养基。

固体培养基平板可在4°C下保存长达两个月。使用前，将平板在室温下的无菌超净台中干燥20分钟。

III. 酵母转化

1. 开始酵母转化实验前，配制以下三种溶液：50% [w/v] 聚乙二醇（PEG）3350 溶液、1 M LiAc 溶液（pH = 8.0）以及 TE 溶液（100 mM Tris，pH = 6.85，10 mM EDTA，pH = 8.0）。将上述溶液过滤除菌后，于 4°C 保存。
2. 使用长柄木签或无菌接种环，从新鲜平板上挑取一个酵母菌落（直径 1–2 mm），接种至含有 3 ml YPD 培养基的 15 ml 聚丙烯管中。短暂涡旋混匀。将培养管置于摇床中，30°C 恒速旋转培养过夜。
3. 次日早晨，从摇床中取出培养物，在室温下以 800 g 离心 5 分钟。离心后，彻底弃去上清液。
4. 将菌体沉淀重悬于 1 ml 重悬缓冲液（10% [v/v] TE 溶液，10% [v/v] 1 M LiAc 溶液）中，通过涡旋充分混匀。
5. 针对每个待转化的质粒，以及一个额外的对照转化，分别将 100 μl 细胞悬液转移至微量离心管中。
6. 向每根离心管中加入 5 μl 单链鲑鱼精子 DNA（10 mg/ml）以及 250–500 ng 待转化的质粒 DNA（对照管除外）。
7. 小心向每根离心管中加入 650 μl 转化溶液（10% [v/v] TE 溶液，10% [v/v] 1 M LiAc 溶液，80% [v/v] 50% [w/v] PEG 溶液），然后涡旋混匀。
8. 将离心管置于摇床中，30°C 孵育 30 分钟。
9. 从摇床中取出离心管，加入 70 μl DMSO，通过轻轻颠倒管体 10–15 次混匀（切勿涡旋，以免破坏细胞）。
10. 将离心管放入预热至 42°C 的水浴中，孵育 15 分钟。
11. 从水浴中取出离心管，立即置于冰上冷却 2 分钟。
12. 待离心管冷却后，在室温下以 800 g 离心 5 分钟。
13. 从微量离心机中取出离心管，使用移液器小心吸除黏稠的上清液。
14. 将每根离心管中的细胞沉淀重悬于 150 μl 无菌双蒸水（DDW）中，将细胞悬液均匀涂布于含有 2% 葡萄糖作为碳源、且缺乏质粒所赋予原养型的氨基酸或核苷酸的合成完全培养基平板上。
15. 将平板打开静置 2 分钟，在超净工作台中晾干。随后将平板置于 30°C 培养箱中培养 2–3 天。
16. 当平板上出现菌落（直径 1–2 mm）后，从每次转化的平板上挑取约 10 个单菌落，并转移至新的新鲜平板上。转移菌落时，制成 2 cm × 2 cm 的菌块，以促进大量酵母细胞生长。将平板置于 30°C 培养箱中培养 2 天。
17. 当酵母菌块生长充分后，从培养箱中取出平板，并用封口膜密封。平板可于 4°C 保存。每隔 10–14 天需将菌落转移至新的新鲜平板上。

IV. 通过免疫印迹验证效应蛋白表达的酵母蛋白提取物制备

1. 从新鲜平板上挑取一个酵母菌落（直径1-2 mm），转移至含有3 ml完全合成培养基的15 ml聚丙烯管中，该培养基添加2%葡萄糖作为碳源，并且不含所选质粒能够提供原养型的氨基酸或核苷酸。将培养管置于摇床中，在30°C下过夜培养。
2. 次日，从摇床中取出培养物，在室温下以800 g离心5分钟。从离心机中取出管子，弃去上清液。
3. 用3 ml无菌去离子水（DDW）重悬细胞沉淀，并通过涡旋混合。
4. 再次离心，弃去上清液，再用3 ml无菌去离子水重悬细胞。
5. 将200 μl细胞悬液转移至另一新的15 ml管中，其中含有3 ml完全合成培养基，添加2%半乳糖和1%棉子糖作为碳源，并且不含所选质粒能够提供原养型的氨基酸或核苷酸。通过涡旋混合后，置于摇床中，在30°C下过夜培养。
6. 次日早晨，取1 ml培养物（若培养物密度较低可取更多）转移至微量离心管中。在室温下以800 g离心5分钟收集细胞。
7. 从此步骤开始，在通风橱内操作，以避免吸入β-巯基乙醇的有毒蒸气。使用移液器小心吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于100 μl冰预冷的裂解液中（含4% [v/v] 5 N NaOH 和 0.5% [v/v] β-巯基乙醇）。剧烈涡旋混合后，冰上孵育30分钟。
8. 在孵育期间，测定将100 μl裂解缓冲液滴定至pH 9–10所需的6 N HCl体积。为此，将10个微量离心管放入管架中，每管加入100 μl裂解缓冲液。向各管中分别加入不同体积（1–10 μl）的6 N HCl，并通过涡旋混合。取少量样品，使用pH指示试纸检测溶液pH值。
9. 孵育结束后，向裂解物中加入上一步确定的HCl体积，并通过涡旋混合（为提高准确性，可将HCl溶液加至管壁侧面，避免移液枪头插入裂解物中）。
10. 向裂解物中加入50 μl 3x上样缓冲液（含30% [v/v] 甘油、15% [v/v] β-巯基乙醇、37.5% [v/v] 500 mM Tris-HCl pH=6.8、0.15% [w/v] 十二烷基硫酸钠 [SDS] 以及少量溴酚蓝），并通过涡旋混合（如果溶液变为黄色，说明pH过低，应加入几微升裂解液直至溶液变蓝）。
11. 用针头在微量离心管盖上刺一个小孔后，将裂解液在加热块上煮沸5分钟。
12. 将微量离心管从加热块上取下，在室温下冷却2分钟。
13. 涡旋裂解液后瞬时离心10秒。取30 μl样品上样至SDS-PAGE凝胶，用于免疫印迹分析。

V. 检测效应子诱导生长抑制表型的点种实验

1. 从新鲜平板上挑取一个携带目标表达质粒的酵母菌落（直径1-2 mm），接种于15 ml聚丙烯管中，管内含3 ml合成完全培养基，添加2%葡萄糖作为碳源，并缺少该表达质粒提供原养型的氨基酸或核苷酸。对携带空质粒的对照酵母菌株重复相同操作。将培养管置于摇床中，于30°C持续旋转培养过夜。
2. 次日，从摇床中取出培养物，在室温下以800 g离心5分钟。从离心机中取出管子，弃去上清液。
3. 用3 ml无菌去离子水（DDW）重悬细胞沉淀，并通过涡旋混合。
4. 重复离心步骤，并用3 ml无菌DDW重悬细胞。
5. 为测定其光密度（OD），将每种培养物100 μl转移至含有900 μl DDW的微量离心管中，涡旋混匀。将管内容物倒入塑料比色皿中，于600 nm波长下测定吸光度（以装有1 ml DDW的比色皿作为空白对照）。通过将比色皿中培养物的OD₆₀₀乘以10倍稀释因子，计算初始培养物的OD₆₀₀。
6. 随后，根据初始培养物的OD₆₀₀值，在无菌微量离心管中制备OD₆₀₀=1.0的细胞悬液（体积1 ml）。
7. 使用3个装有900 μl无菌DDW的无菌微量离心管，从上一步制备的每种细胞悬液（OD₆₀₀=1.0）中进行连续三轮10倍系列稀释（OD₆₀₀=0.1、0.01和0.001）。
8. 准备两块含有合成完全培养基的平板，培养基中缺少所选质粒提供原养型的氨基酸或核苷酸。其中一块平板的培养基添加2%葡萄糖，另一块添加2%半乳糖和1%棉子糖。将平板在室温下的无菌超净台中晾干20分钟，并放置于网格上。
9. 对每种培养物，分别从四个稀释度中各取10 μl，按顺序点样于抑制性培养基和诱导性培养基平板上。
10. 点样后，将平板在超净台中敞口放置数分钟。待液滴干燥后，盖上平板并置于30°C培养箱中培养2-3天。
11. 培养结束后，取出平板并分析酵母生长情况。首先确认在含抑制性培养基的平板上各点的细胞密度相近。然后，在含诱导性培养基的平板上，比较表达目标效应蛋白的菌株与携带空载体菌株的生长差异。
    
    注意：某些效应蛋白可能靶向在标准实验室培养条件下对酵母生长非限速的细胞过程。为了检测此类效应蛋白的生长抑制表型，可在诱导培养基中添加可改变酵母细胞功能的化合物，从而提高其对效应蛋白的敏感性。有关可能适用于本实验流程的化学物质列表，请参见Parsons等（2004）²。

VI. 代表性结果

图1展示了一种典型的酵母点种实验及由III型效应子表达诱导的生长抑制表型检测结果。在本实验中，来自革兰氏阴性植物病原菌番茄泛菌Pseudomonas syringae pv. tomato（Pst）的III型效应子AvrPto、HopAA1-1和AvrE1在酵母菌株BY4741中通过含有着丝粒的质粒pGML10进行表达，并检测其抑制酵母生长的能力。分别将表达Pst III型效应子（受半乳糖诱导型GAL1启动子调控）或携带空载体的酵母培养物进行系列稀释后，点种于抑制性（葡萄糖）或诱导性（半乳糖）培养基上（图1）。在抑制性培养基上，携带表达AvrPto和HopAA1-1质粒的酵母菌株与携带空载体的对照菌株表现出相似的生长状态。然而，在同一培养基上，携带AvrE1的酵母菌株生长略有减弱，可能是由于GAL1启动子存在一定程度的泄漏表达以及AvrE1本身具有较强的细胞毒性所致。在诱导条件下，AvrE1效应子的表达导致严重的生长抑制表型，表现为任何稀释梯度下均无菌落形成。正如Munkvold等³先前观察到的，HopAA1-1的表达也导致显著的生长抑制，而AvrPto则未表现出任何抑制效应。

图1. 表达丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato，Pst）III型效应子AvrE1和HopAA1-1导致的酵母生长抑制。 携带质粒pGML10（空载体或含有GAL1启动子驱动的AvrPto、HopAA1-1或AvrE1的半乳糖诱导表达盒）的酵母菌株（BY4741）在补充有葡萄糖（2%）作为碳源且缺乏亮氨酸的合成完全培养基中于30°C过夜培养。将培养物洗涤后调整至OD₆₀₀=1.0，并进行10倍系列稀释，点样于缺乏亮氨酸并含有葡萄糖（2%）或半乳糖（2%）和棉子糖（1%）的合成完全固体培养基上。分别在葡萄糖和半乳糖培养基中培养2天和3天后拍照记录生长情况。

讨论

在本研究中，我们展示了如何利用出芽酵母Saccharomyces cerevisiae作为异源表达系统来表达细菌III型效应蛋白，并介绍了如何鉴定效应蛋白诱导的生长抑制表型。重要的是，这些表型可用于遗传筛选，以鉴定能够抑制效应蛋白对酵母生长产生负面影响的抑制因子。这些抑制因子可能是该效应蛋白的直接作用靶点，也可能是参与效应蛋白所影响的细胞过程的相关蛋白。迄今为止，已有多种来自动植物细菌病原菌的III型效应蛋白在酵母中成功表达，其中部分效应蛋白引起的生长抑制表型已被用于鉴定其作用的细胞过程或信号通路^1,4。在多项研究中，酵母中效应蛋白的毒性还被成功用于发现新的细菌效应蛋白⁵。此外，效应蛋白诱导的生长抑制表型还可应用于药物筛选，通过化学文库筛选能够抑制效应蛋白在酵母中毒性的化合物⁶。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
酵母提取物	Difco Laboratories	212750
蛋白胨	Difco Laboratories	211677
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G5767
琼脂	Difco Laboratories	214010
氢氧化钠 (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
不含氨基酸的酵母氮源基础培养基	Difco Laboratories	291940
酵母合成缺陷型培养基补充剂	Sigma-Aldrich	Y2001
D-半乳糖	Sigma-Aldrich	G0750	>99%；<0.1% 葡萄糖
D-棉子糖	Sigma-Aldrich	R0250	>98%
L-亮氨酸	Sigma-Aldrich	L8000
尿嘧啶	Sigma-Aldrich	U0750
L-色氨酸	Sigma-Aldrich	T0254
L-组氨酸	Sigma-Aldrich	H6034
单链DNA（来自鲑鱼精）	Sigma-Aldrich	D7656
二甲基亚砜 (DMSO)	Sigma-Aldrich	D5879	干燥保存
盐酸 (HCl)	Sigma-Aldrich	H1758
聚乙二醇 (PEG) 3350	Sigma-Aldrich	P4338
乙酸锂 (LiAc)	Sigma-Aldrich	L4958
Tris (碱)	JT Baker	4109-02
乙二胺四乙酸 (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
β-巯基–乙醇	Sigma-Aldrich	M6250
甘油	Sigma-Aldrich	G5516
溴酚蓝	Sigma-Aldrich	B6131
十二烷基硫酸钠 (SDS)	Merck & Co., Inc.	8.22050.1000
离心管 (15 ml)	Corning	430052	无菌
分光光度计比色皿 (10×4×45 mm)	Sarstedt Ltd	67.742
接种环	Sigma-Aldrich	Z643009	无菌
封口膜 (Parafilm)	Sigma-Aldrich	P7543
pH 指示试纸，pH 6.5–10.0	Merck & Co., Inc.	1.09543.0001