鉴定酵母中表达细菌III型效应蛋白所诱导的生长抑制表型

摘要

在本视频中，我们介绍了一种在酵母中表达细菌III型效应子并鉴定效应子诱导的生长抑制表型的方法。此类表型可进一步用于阐明效应子的功能及其作用靶点。

摘要

许多革兰氏阴性致病菌利用III型分泌系统将一系列效应蛋白转运至宿主细胞的细胞质中。在细胞内，III型效应蛋白通过干扰宿主细胞的正常生理过程，抑制免疫反应并促进病原体的增殖。迄今为止，已鉴定出多种植物和动物细菌病原体的III型效应蛋白，但其中仅有少数被深入表征。由于特定细菌菌株的效应蛋白组存在功能冗余、效应蛋白对毒力的提升作用较为细微、其功能可能仅在特定感染阶段发挥作用，以及某些病原体在遗传操作上的困难，导致对这些效应蛋白功能的研究受到限制。在出芽酵母中表达III型效应蛋白Saccharomyces cerevisiae可能有助于克服这些限制，并促进对效应蛋白的功能表征。由于III型效应蛋白通常靶向酵母与其他真核生物之间保守的细胞过程，其在酵母中的表达可能导致生长抑制表型，从而可用于阐明效应蛋白的功能与靶标。利用酵母进行细菌效应蛋白功能研究的其他优势还包括：遗传操作简便、绝大多数开放阅读框（ORFs）的预测功能信息已知，以及可用于全基因组和小规模实验的多种工具与资源丰富。本文讨论了设计用于表达细菌III型效应蛋白的酵母系统时需考虑的关键因素，包括驱动目标效应基因表达的合适启动子、效应基因的拷贝数、用于验证蛋白表达的表位标签以及酵母菌株。我们提供了在酵母中诱导效应蛋白表达并通过免疫印迹验证其表达的实验方案。此外，我们还描述了一种在琼脂平板上的点样实验，用于鉴定效应蛋白诱导的生长抑制表型。本实验方案的应用可扩展至研究任何病原体通过特定转运机制递送至宿主细胞内的致病因子。

方案

I. 设计用于III型效应蛋白的酵母表达系统

校准适用于表达目标III型效应蛋白的酵母系统是一项重要工作，可能需要进行多次尝试与调整。在设计此类系统时，应考虑并优化以下几个关键因素：1）驱动效应蛋白表达的启动子，2）效应蛋白基因的拷贝数，3）用于验证蛋白表达的表位标签，以及4）酵母菌株。

1) 启动子

由于细菌III型效应子可能对酵母细胞具有毒性，因此应使用可诱导启动子来控制其表达。GAL1启动子常用于此目的，其活性受培养基中碳源的调控：葡萄糖可抑制其活性，而半乳糖可诱导其表达。然而，有报道称该启动子在抑制条件下存在轻微的渗漏表达，可能导致非预期的毒性。若遇到类似问题，建议通过下文所述方法降低效应子基因的拷贝数，或使用其他可诱导启动子（如MET3或CUP1启动子）¹。本文描述了利用半乳糖诱导型启动子表达效应蛋白的操作步骤。

2) 基因拷贝数

影响蛋白表达水平的另一个参数是细胞内效应基因的拷贝数。当效应基因由2微米质粒携带时（每细胞40-60拷贝），可实现高水平表达；使用含着丝粒的质粒（每细胞1-3拷贝）可获得中等水平表达；而当效应基因通过同源重组整合至酵母基因组时，则实现低水平表达。通过结合含着丝粒的载体与GAL1启动子，我们已成功表达了约50种植物病原菌Xanthomonas campestris pv. vesicatoria和Pseudomonas syringae pv. tomato的效应蛋白，其表达水平可通过免疫印迹分析检测，并且在抑制条件下泄漏表达极低（Salomon和Sessa，未发表）。

3) 表位标签

如果缺乏针对目标效应蛋白的抗体，可将表位标签与效应蛋白融合，以便通过免疫印迹检测其表达。常用的标签包括 Myc、血凝素（HA）或 Flag，这些标签均有可靠的商业化抗体可供使用。建议仅使用一个标签拷贝，以尽量减少对效应蛋白结构和活性产生不良影响的可能性。

4) 酵母菌株

用于表达的酵母菌株必须具备对表达载体选择标记的营养缺陷型这一基本要求。需要注意的是，不同的酵母菌株可能对某些效应蛋白的表达表现出不同的敏感性。例如，我们观察到BY4741和W303菌株对多种野油菜黄单胞菌辣椒致病变种（Xanthomonas campestris pv. vesicatoria）效应蛋白的敏感性存在差异（Salomon和Sessa，未发表）。因此，最好在不同的酵母菌株中测试目标效应蛋白。

二、酵母培养基的制备

对于不含任何载体的酵母菌株的培养，使用YPD培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨和2% [w/v]葡萄糖）作为生长培养基。对于固体培养基，向溶液中加入2% [w/v]琼脂（如果固体培养基过软，可在灭菌前向培养基中添加0.05% [v/v]的5 N NaOH储备液）。我们建议在最终体积90%的条件下配制不含葡萄糖的培养基，并进行高压灭菌。使用前，用过滤除菌的20% [w/v]葡萄糖溶液补足至总体积的100%（将20%葡萄糖溶液保存在4°C以防止污染）。

对于含有提供可选择标记（亮氨酸、尿嘧啶、组氨酸或色氨酸）营养互补质粒的酵母菌株的培养，使用不含亮氨酸、尿嘧啶、组氨酸和色氨酸的合成缺失培养基（6.7 g/L 无氨基酸酵母氮源基础培养基，1.4 g/L 酵母合成缺失培养基补充剂），并添加 2% [w/v] 葡萄糖，或 2% [w/v] 半乳糖和 1% [w/v] 棉子糖。对于固体培养基，向溶液中加入 2% [w/v] 琼脂。建议将培养基配制为最终体积的 90%，并进行高压灭菌。使用前，用滤膜除菌的 20% 葡萄糖溶液，或滤膜除菌的 20% 半乳糖 + 10% 棉子糖溶液补足至 100% 体积，具体取决于所需碳源（将 20% 葡萄糖溶液以及 20% 半乳糖 + 10% 棉子糖溶液置于 4°C 保存以防止污染）。根据表达质粒的可选择标记，在使用前添加其他氨基酸或尿嘧啶（每升培养基加入 10 ml 1 g/100 ml 亮氨酸储备液，或 10 ml 200 mg/100 ml 尿嘧啶储备液，或 2 ml 1 g/100 ml 组氨酸储备液，或 2 ml 1 g/100 ml 色氨酸储备液）。配制亮氨酸和尿嘧啶储备液时，通过高压灭菌进行灭菌，并在室温下保存。配制组氨酸和色氨酸储备液时，通过过滤灭菌，用铝箔包裹瓶体以避光，并在 4°C 下保存。在下述实验步骤中，添加了亮氨酸、尿嘧啶、组氨酸和色氨酸的合成缺失培养基称为合成完全培养基。

固体培养基平板可在4°C下保存长达两个月。使用前，需在室温下的无菌超净工作台中干燥20分钟。

III. 酵母转化

1. 在开始酵母转化实验前，配制以下三种溶液：50% [w/v] 聚乙二醇（PEG）3350 溶液、1 M LiAc 溶液（pH=8.0）以及 TE 溶液（100 mM Tris，pH=6.85，10 mM EDTA，pH=8.0）。将溶液过滤除菌后保存于 4°C.
2. 使用一根长的木棒或无菌接种环，从新鲜平板上挑取一个酵母菌落（直径1-2 mm），接种至含有3 ml YPD培养基的15 ml聚丙烯管中。短暂涡旋混匀。将培养管置于摇床中，37°C过夜培养 30°C 持续旋转。
3. 清晨，从转瓶中取出培养物，在室温下以800 g离心5分钟。离心后，彻底移除上清液。
4. 将细胞重悬于1 ml重悬缓冲液（10% [v/v] TE溶液，10% [v/v] 1 M LiAc溶液）中，涡旋混匀。
5. 对于每种需要转化的质粒以及一个额外的对照转化，转移 100 μl 将细胞悬液转移至微量离心管中。
6. 向每支试管中加入 5 μl 鲑鱼精子单链DNA（10 mg/ml）250-500 ng 及待转化的质粒DNA（对照管除外）。
7. 小心地向每根试管中加入 650 μl 转化溶液（10% [v/v] TE 溶液、10% [v/v] 1 M LiAc 溶液、80% [v/v] 50% [w/v] PEG 溶液）并涡旋。
8. 孵育于 30°C 在滚轴上孵育30分钟。
9. 从摇床中取出试管，加入 70 μl 加入DMSO，通过倒置试管10–15次混匀（严禁涡旋，以免细胞破裂）。
10. 将试管放入 42°C 预热的水浴中孵育15分钟。
11. 从水浴中取出试管，立即置于冰上放置 2 min。
12. 待试管冷却后，在室温下以800 g离心5分钟。
13. 从微量离心机中取出离心管，用移液器小心移除黏稠的上清液。
14. 重悬各管中的细胞沉淀 150 μl 加入无菌双蒸水（DDW），并将细胞悬液涂布于含有2%葡萄糖作为碳源、且不含质粒所赋予原养型的氨基酸或核苷酸的合成完全培养基平板上。
15. 将培养皿打开静置2分钟，于超净工作台中晾干。将培养皿放入 30°C 孵育器中孵育两到三天。
16. 当平板上出现菌落（直径 1-2 mm）后，从每次转化中挑选约 10 个单菌落，并转移至新的平板上。转移菌落时，制成 2 cm × 2 cm 的菌块，以促进大量酵母细胞生长。将平板置于培养箱中培养，温度为 30°C 两天。
17. 当酵母菌落长成后，从培养箱中取出培养皿，并用封口膜密封。培养皿可保存于 4°C每10至14天将菌落转接到新鲜培养基平板上。

四、制备酵母蛋白提取物以通过免疫印迹验证效应因子表达

1. 从新鲜平板上挑取一个酵母菌落（直径1-2 mm），放入含有3 ml补充有2%葡萄糖作为碳源的适当合成完全培养基的15 ml聚丙烯管中，该培养基中不含所选质粒可提供原养型的氨基酸或核苷酸。将培养管置于摇床中，在30°C下孵育过夜。
2. 次日，从摇床中取出培养物，在室温下以800 g离心5分钟。从离心机中取出管子，弃去上清液。
3. 用3 ml无菌去离子水（DDW）重悬细胞沉淀，并通过涡旋混合。
4. 再次离心，弃去上清液，并用3 ml无菌去离子水重悬细胞。
5. 将200 μl细胞悬液转移至一个新的15 ml管中，该管内含有3 ml补充有2%半乳糖和1%棉子糖作为碳源的合成完全培养基，且不含所选质粒可提供原养型的氨基酸或核苷酸。通过涡旋混合，放入摇床中，在30°C下孵育过夜。
6. 次日早晨，取1 ml培养物（密度较低的培养物可取更多）转移至微量离心管中。在室温下以800 g离心5分钟收集细胞。
7. 此后操作均需在通风橱中进行，以避免吸入β-巯基乙醇的有毒蒸气。使用移液器小心吸除上清液，并用100 μl冰浴裂解液（4% [v/v] 5 N NaOH，0.5% [v/v] β-巯基乙醇）重悬细胞沉淀。剧烈涡旋混合，并在冰上孵育30分钟。
8. 在孵育期间，确定将100 μl裂解缓冲液滴定至pH 9-10所需的HCl（6 N）体积。为此，将10个微量离心管放入试管架中，每管加入100 μl裂解缓冲液。向各管中加入不同体积（1-10 μl）的HCl（6 N），并通过涡旋混合。取少量样品，使用pH指示试纸检测溶液pH值。
9. 孵育结束后，向裂解物中加入上一步确定的HCl体积，并通过涡旋混合（为提高准确性，可将HCl溶液加至管壁侧面，避免移液枪头插入裂解物中）。
10. 向裂解物中加入50 μl 3×上样缓冲液（30% [v/v]甘油，15% [v/v] β-巯基乙醇，37.5% [v/v] 500 mM Tris-HCl pH=6.8，0.15% [w/v]十二烷基硫酸钠[SDS]及少量溴酚蓝），并通过涡旋混合（若溶液变黄，说明pH过低，应加入几微升裂解液直至溶液变蓝）。
11. 用针头在微量离心管盖上刺一个小孔后，将裂解液在加热块上煮沸5分钟。
12. 将微量离心管从加热块上取下，在室温下冷却2分钟。
13. 涡旋裂解液后短暂离心10秒。取30 μl样品上样至SDS-PAGE凝胶，用于免疫印迹分析。

V. 检测效应子诱导生长抑制表型的点板实验

1. 从新鲜平板上挑取一个携带目标表达质粒的酵母菌落（直径1-2 mm），接种至15 ml聚丙烯管中，加入3 ml合成完全培养基，该培养基以2%葡萄糖作为碳源，并且不含有表达质粒所赋予原养型的氨基酸或核苷酸。对携带空质粒的对照酵母菌株重复相同操作。将培养管置于摇床中，于30°C恒速旋转培养过夜。
2. 次日，从摇床中取出培养物，在室温下以800 g离心5分钟。从离心机中取出离心管，弃去上清液。
3. 用3 ml无菌去离子水（DDW）重悬细胞沉淀，并通过涡旋混合。
4. 重复离心步骤，并用3 ml无菌去离子水（DDW）重悬细胞。
5. 为测定其光密度（OD），将每种培养物各100 μl转移至含有900 μl去离子水的微量离心管中，涡旋混匀。将管中内容物倒入塑料比色皿，于600 nm波长下测定吸光度（以装有1 ml去离子水的比色皿作为空白对照）。通过将比色皿中培养物测得的OD₆₀₀乘以10倍稀释因子，计算初始培养物的OD₆₀₀。
6. 随后，根据初始培养物的OD₆₀₀，在无菌微量离心管中配制OD₆₀₀=1.0的细胞悬液（体积1 ml）。
7. 使用3个装有900 μl无菌去离子水的无菌微量离心管，对上一步制备的每种细胞悬液（OD₆₀₀=1.0）进行连续三轮10倍梯度稀释（OD₆₀₀=0.1、0.01和0.001）。
8. 准备两块含有合成完全培养基的平板，该培养基中不含有目标质粒所赋予原养型的氨基酸或核苷酸。其中一块平板的培养基中添加2%葡萄糖，另一块则添加2%半乳糖和1%棉子糖。将平板在室温下的无菌超净台中晾干20分钟，并放置于网格上。
9. 对每种培养物，分别从四种稀释液中各取10 μl，依次点样于抑制性培养基和诱导性培养基平板上。
10. 点样后，将平板在超净台中敞口数分钟。待液滴干燥后，盖上平板并置于30°C培养箱中培养2-3天。
11. 培养结束后取出平板，观察并分析酵母生长情况。首先确认在抑制性培养基平板上的细胞接种密度是否相近。然后，在诱导性培养基平板上，比较表达目标效应蛋白的菌株与携带空载体的对照菌株的生长差异。
    
    注意：某些效应蛋白可能靶向在标准实验室培养条件下对酵母生长非限速的细胞过程。为了检测此类效应蛋白的生长抑制表型，可在诱导培养基中添加可改变酵母细胞功能的化合物，从而提高其对效应蛋白的敏感性。有关可能适用于本实验流程的化学物质列表，请参阅Parsons等（2004）²。

VI. 代表性结果

图1展示了一种典型的酵母点种实验，以及由表达III型效应子所诱导的生长抑制表型的检测结果。在本实验中，革兰氏阴性植物病原细菌番茄丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae pv. tomato，Pst）的III型效应子AvrPto、HopAA1-1和AvrE1通过含有着丝粒的质粒pGML10在酵母菌株BY4741中表达，并检测其抑制酵母生长的能力。分别将表达Pst III型效应子的酵母培养物（由半乳糖诱导型GAL1启动子驱动）以及携带空载体的对照培养物进行系列稀释，点种于抑制性（葡萄糖）或诱导性（半乳糖）培养基上（图1）。在抑制性培养基上，携带表达AvrPto和HopAA1-1质粒的酵母菌株的生长情况与携带空载体的对照菌株相似。然而，在同一培养基上，携带AvrE1的酵母菌株表现出轻微的生长减弱，可能与GAL1启动子存在一定程度的泄漏表达以及AvrE1本身较强的细胞毒性有关。在诱导条件下，AvrE1效应子的表达导致严重的生长抑制表型，表现为任何稀释梯度下均无菌落形成。正如Munkvold等人先前报道的那样³，HopAA1-1的表达也导致显著的生长抑制，而AvrPto则未表现出任何抑制效应。

图 1. 表达丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato，Pst）III型效应子 AvrE1 和 HopAA1-1 导致的酵母生长抑制。 携带质粒 pGML10（空载体或含有由 GAL1 启动子驱动的半乳糖诱导型表达盒，用于表达 AvrPto、HopAA1-1 或 AvrE1）的酵母菌株（BY4741）在补充有葡萄糖（2%）作为碳源且缺乏亮氨酸的合成完全培养基中过夜培养。培养物经洗涤后调整至 OD₆₀₀=1.0，并进行10倍系列稀释，点样于缺乏亮氨酸并含有葡萄糖（2%）或半乳糖（2%）与棉子糖（1%）的合成完全固体培养基上。分别在30°C培养2天和3天后拍摄酵母在葡萄糖和半乳糖培养基上的生长情况照片。

讨论

在本研究中，我们展示了如何利用出芽酵母Saccharomyces cerevisiae作为异源表达系统来表达细菌III型效应蛋白，并介绍了如何鉴定效应蛋白诱导的生长抑制表型。重要的是，这些表型可用于遗传筛选，以鉴定能够抑制效应蛋白对酵母生长产生负面影响的抑制因子。这些抑制因子可能是该效应蛋白的直接作用靶点，也可能是参与效应蛋白所影响的细胞过程的相关蛋白。迄今为止，已有多种来自动植物细菌病原菌的III型效应蛋白在酵母中成功表达，其中部分效应蛋白引起的生长抑制表型已被用于鉴定其作用的细胞过程或信号通路^1,4。在多项研究中，酵母中效应蛋白的毒性还被成功用于发现新的细菌效应蛋白⁵。此外，效应蛋白诱导的生长抑制表型还可应用于药物筛选，通过化学文库筛选能够抑制效应蛋白在酵母中毒性的化合物⁶。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
酵母提取物	Difco Laboratories	212750
蛋白胨	Difco Laboratories	211677
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G5767
琼脂	Difco Laboratories	214010
氢氧化钠 (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
不含氨基酸的酵母氮源基础培养基	Difco Laboratories	291940
酵母合成缺陷型培养基补充剂	Sigma-Aldrich	Y2001
D-半乳糖	Sigma-Aldrich	G0750	>99%；<0.1% 葡萄糖
D-棉子糖	Sigma-Aldrich	R0250	>98%
L-亮氨酸	Sigma-Aldrich	L8000
尿嘧啶	Sigma-Aldrich	U0750
L-色氨酸	Sigma-Aldrich	T0254
L-组氨酸	Sigma-Aldrich	H6034
单链DNA（来自鲑鱼精）	Sigma-Aldrich	D7656
二甲基亚砜 (DMSO)	Sigma-Aldrich	D5879	干燥保存
盐酸 (HCl)	Sigma-Aldrich	H1758
聚乙二醇 (PEG) 3350	Sigma-Aldrich	P4338
乙酸锂 (LiAc)	Sigma-Aldrich	L4958
Tris (碱)	JT Baker	4109-02
乙二胺四乙酸 (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
β-巯基–乙醇	Sigma-Aldrich	M6250
甘油	Sigma-Aldrich	G5516
溴酚蓝	Sigma-Aldrich	B6131
十二烷基硫酸钠 (SDS)	Merck & Co., Inc.	8.22050.1000
离心管 (15 ml)	Corning	430052	无菌
分光光度计比色皿 (10×4×45 mm)	Sarstedt Ltd	67.742
接种环	Sigma-Aldrich	Z643009	无菌
封口膜 (Parafilm)	Sigma-Aldrich	P7543
pH 指示试纸，pH 6.5–10.0	Merck & Co., Inc.	1.09543.0001