本文介绍如何使用安捷伦鱼类物种鉴定系统，通过提取DNA并进行PCR和RFLP分析来鉴定鱼类的物种。
本文内容
摘要
摘要
我们开发了一种快速、简便且准确的基于DNA的筛查方法，用于鉴定新鲜及加工海产品样品中存在的鱼类物种。该方法具有良好的通用性，通过PCR扩增从鱼类样品中提取的基因组DNA，随后进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析，产生可在Agilent 2100 Bioanalyzer上分辨的片段图谱，并利用RFLP图谱匹配软件比对以确定正确的物种。
该鱼类鉴定方法采用一种简单、可靠的基于离心柱的方案，从鱼类样本中分离DNA。样本经蛋白酶K处理，以释放核酸进入溶液。随后将样本悬浮于结合缓冲液中，并加载至含有硅基纤维基质的微型离心柱中，使样本中的核酸与纤维基质结合。通过洗涤固定化的核酸以去除污染物，最终在100 μl洗脱液中回收总DNA。所提取的DNA可直接用于PCR扩增，所用引物可结合所有鱼类基因组中的保守序列。PCR产物随后用三种不同的限制性内切酶进行消化，并在Agilent 2100 Bioanalyzer上进行分离。通过分析消化反应产生的片段长度，结合包含商业重要鱼类物种实验获得的RFLP图谱数据库的RFLP模式匹配软件，可确定DNA样本来源的鱼类物种。
方案
1：准备鱼类样本以进行DNA提取
- 针对每个待检测的鱼类样本，取一片重量在 10 mg 至 1 g 之间的鱼组织（生或熟），放入一个 1.5-ml 微量离心管中。可参考下图，根据样本大小估算生鱼样本的重量。
图 1. 基于样本尺寸的鱼类样本质量估算。 - 将蛋白酶 K 消化缓冲液在 65°C 的培养箱或水浴中预热 5 分钟。
- 通过将每份样本加入 200 μl 蛋白酶 K 消化缓冲液和 20 μl 蛋白酶 K，配制蛋白酶 K 工作液。
注意：每次使用前均需新鲜配制蛋白酶 K 工作液。 - 向每个含有鱼样本的 1.5-ml 管中加入 220 μl 蛋白酶 K 工作液。将各管在 65°C 的培养箱或水浴中孵育 10 分钟。
- 将各管在微量离心机中以 14,000 × g 离心 3 至 5 分钟，使未消化的组织沉淀。
- 将每份上清液的 150 μl 转移至新的 1.5-ml 管中。避免转移管底的未消化物质或管顶可能存在的油状物。 这些上清液即为用于提取基因组 DNA 的样本。
2：提取基因组 DNA
- 在无菌容器（聚丙烯管或玻璃瓶）中，通过将每份样品加入 320 μl 的 90% 亚砜烷和 170 μl 核酸结合缓冲液，配制亚砜烷与核酸结合缓冲液的工作液。
建议配制足够量的该混合液，以处理未来 4 周内计划检测的所有样品。该混合液可在室温下保存最多 30 天。储存期间应避免光照。 - 向每份鱼样品中加入 490 μl 上述第 1 步配制的亚砜烷/结合缓冲液混合液。通过涡旋振荡或反复移液使样品充分均质化。加入该混合液后，每份样品的总体积将达到 640 μl。
- 将每份样品转移至已置于 2-ml 收集管（提供）中的 DNA 结合旋转杯中，并将收集管的盖子扣紧在旋转杯顶部。
- 在微量离心机中以 14,000 × g 离心 1 分钟，使 DNA 结合到旋转杯基质上。
- 取出并保留旋转杯，弃去滤液。对每份样品，将旋转杯重新放入收集管中，然后加入 500 μl 1× 高盐洗涤缓冲液，并盖上管盖。
- 在微量离心机中以 14,000 × g 离心 1 分钟。
- 取出并保留旋转杯，弃去滤液。对每份样品，将旋转杯重新放入收集管中，然后加入 500 μl 80% 乙醇，并盖上管盖。
- 在微量离心机中以 14,000 × g 离心 1 分钟。
- 重复步骤 7 和 8 两次，共进行 3 次使用 500 μl 80% 乙醇的洗涤。
- 第三次使用 80% 乙醇洗涤后，取出并保留旋转杯，弃去滤液。将旋转杯放回各自的收集管中，在微量离心机中以 14,000 × g 离心 2 分钟，以干燥纤维基质。
- 将旋转杯转移至 1.5-ml 收集管中。直接向每个旋转杯内的纤维基质上加入 100 μl 洗脱缓冲液。将收集管的盖子扣紧在旋转杯上，在室温下孵育 1 分钟。
- 在微量离心机中以最大转速离心 1 分钟。
- 纯化的 DNA 存在于微量离心管中的洗脱缓冲液中。弃去旋转杯，并盖上收集管。DNA 可在 4°C 下保存最多一个月。如需长期保存，应将 DNA 置于 20°C 或 80°C 下储存。
- 如有需要，可使用分光光度计测定 DNA 样品的浓度。
基因组DNA提取方案通常获得的样品浓度范围为5 ng/μl至500 ng/μl。PCR-RFLP方案适用于DNA浓度在0.05 ng/μl至2000 ng/μl范围内的样品。
3：设置 PCR 反应
- 通过将 8 μl 的鲑鱼 DNA 原液与 32 μl 无菌、无 DNase 的水混合，制备 50 ng/μl 的阳性对照 DNA 稀释液。涡旋混匀。
稀释后的样品可于 4°C 保存以供后续使用。 - 按以下表格中的组分顺序配制反应体系。通过将下表所列体积按比例放大，为所有需同时进行的 PCR 反应配制一份统一的试剂混合液。除待测 DNA 样品外，还需设置一个阳性对照反应和一个无模板对照反应。建议为每个待测 DNA 样品设置两个重复的 PCR 反应。试剂混合液的总量应满足所有反应所需体积，并额外增加一个反应的体积。
例如，若您有 5 个待测 DNA 样品，则应配制足够用于 8 个反应 的试剂混合液（5 个待测反应、1 个阳性对照、1 个无模板对照和 1 个余量），或在包含待测反应重复的情况下配制足够用于 13 个反应 的混合液（10 个重复待测反应、1 个阳性对照、1 个无模板对照和 1 个余量）。
PCR 试剂混合液组分 单个反应体积 五个反应体积 dH2O, 无菌 9 μl 45 μl 2x PCR Master Mix 12.5 μl 62.5 μl 引物混合液 2.5 μl 12.5 μl 总体积 24 μl 120 μl - 充分涡旋混匀试剂混合液，然后将 24 μl 分装至各个薄壁 PCR 反应管中。
- 向阳性对照反应管中加入 1 μl 稀释后的阳性对照 DNA。向各待测样品管中加入 1 μl 待测 DNA 样品。对于无模板对照反应，用 1 μl 无 DNase 水替代 DNA 加入。
为避免交叉污染，每种 DNA 样品应使用新的移液器吸头。加样后，通过快速上下吹打数次混匀反应体系。 - 盖紧反应管，涡旋混匀后短暂离心。
4：运行 PCR 程序
- 将反应体系放入热循环仪中，并运行下方所示的PCR程序。
PCR循环程序步骤 循环次数 温度 持续时间 1 1 95°C 5分钟 2 40 95°C
50°C
72°C30秒
30秒
30秒3 1 72°C 7分钟
5：用限制性内切酶消化PCR产物
- 标记将用于限制性消化反应的0.5 ml离心管或0.2 ml联管。每个PCR反应需用三种不同的限制性内切酶进行消化：DdeI、HaeIII和NlaIII。因此，针对每个PCR反应，分别标记三个独立的离心管，注明PCR样品名称及限制性内切酶名称。
- 准备 DdeI 消化反应的试剂混合物，需将以下组分混合 依次。 为所有 DdeI 消化反应（另加至少一个反应体积的余量）配制单一的试剂混合液，各组分按倍数使用。PCR 完成后，用限制性内切酶处理 PCR 反应产物，进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析。
DdeI 消化试剂混合物组分 体积 dH2O，无菌 1.5 μl 10x DdeI 缓冲液 0.5 μl 10x DdeI 酶 0.5 μl - 充分涡旋混匀试剂混合物，然后分装 2.5 μl 加入已标记为 DdeI 的各个反应管中。
- 准备 HaeIII 消化反应的试剂混合物，需混合以下组分 依次。 为所有 HaeIII 消化反应（另加至少一个反应体积的余量）配制单一的试剂混合液，使用各组分的倍数进行配制。
HaeIII 消化试剂混合物组分 体积 dH2O，无菌 1.5 μl 10x HaeIII 缓冲液 0.5 μl 10x HaeIII 酶 0.5 μl - 充分涡旋混匀试剂混合物，然后分装 2.5 μl 加入已标记为 HaeIII 的各个反应管中。
- 准备 NlaIII 消化反应的试剂混合物，将以下组分混合 依次。 为所有 NlaIII 消化反应（外加至少一个反应体积的余量）配制单一的试剂混合液，使用各组分的倍数进行配制。
NlaIII 消化试剂混合物组分 体积 dH2O，无菌 1.5 μl 10x NlaIII 缓冲液 0.5 μl 10x NlaIII 酶 0.5 μl - 充分涡旋混匀试剂混合物，然后分装 2.5 μl 到已标记用于 NlaIII 的各个反应管中。
- 每个消化反应中，加入 2.5 μl 将适量的PCR产物加入已标记的试管中。所有的测试PCR反应以及阳性对照反应均需用三种限制性内切酶进行消化。
- 涡旋振荡消化反应液，然后短暂离心试管。
- 将所有消化反应置于 37°C 2小时。该孵育步骤可在热循环仪中进行。如需要，反应物可置于 37°C 过夜。
- 将反应物转移至 65°C 15分钟。此步骤可在热循环仪中进行。
- 添加 1 μl 加入 60 mM EDTA（试剂盒提供）至各反应体系中，充分涡旋混匀。
6：分析限制性酶切图谱
- 制备凝胶-染料混合液，将DNA芯片放置于芯片预处理工作站上，并将混合液加载至DNA芯片中。
- 用移液器将5 μl DNA标记物加入标记有梯形符号的孔以及芯片上的12个样品孔中。
DNA标记物由DNA 1000试剂盒中的绿色盖管提供。 - 用移液器将1 μl DNA分子量标准加入标记有梯形符号的孔中。
DNA分子量标准由DNA 1000试剂盒中的黄色盖管提供。 - 针对每个DNA样品，根据下图所示指南，将各限制性消化反应产物1 μl分别加入芯片的12个样品孔之一中。采用此方法，1–3号孔用于阳性对照样品的3个消化反应，4–6号孔用于测试样品1的3个消化反应，7–9号孔用于测试样品2的3个消化反应，10–12号孔用于测试样品3的3个消化反应。在Agilent 2100 Bioanalyzer上分析限制性消化反应，以确定消化过程中产生的片段长度。Agilent DNA 1000试剂盒使用指南中提供了在Bioanalyzer上运行实验芯片的完整操作说明。为方便起见，以下提供简要操作流程。
图2. 芯片上样品的排列方式。
若DNA样品少于4个，请向未使用的孔中加入1 μl水。若DNA样品超过4个，则需运行多个芯片。注意：无需在每块芯片上都运行阳性对照样品。 - 将芯片水平放入IKA涡旋混合器的适配器中，在2400 rpm条件下涡旋60秒。
- 将芯片插入Agilent 2100 Bioanalyzer中并启动芯片运行。原始信号将在仪器界面中实时显示。
运行结束后，系统将根据峰识别算法的设定参数自动识别所有样品的峰。若认为算法未能检测到真实存在的峰，可降低“峰高阈值”设定值，以便算法识别该峰。 - 进入“Assay”界面，选择芯片汇总标签页。在“样品名称”字段中，为芯片上的全部12个孔输入对应的样品名称，如下图所示。
图3. 芯片汇总标签页中的样品名称输入界面。
7：使用 RFLP Matcher 鉴定测试样本物种
可使用安捷伦软件应用程序 RFLP Decoder，根据消化反应中产生的片段长度来鉴定测试DNA样本的鱼类物种。表7 阳性对照限制性内切酶预期产物大小中的预期DNA片段大小（bp） DdeI 117, 332, 340 HaeIII 40, 105, 333 NlaIII 459 本文提供的操作说明使用 RFLP Matcher 中的默认分析设置。有关软件操作及结果解读的详细信息，请参考软件的帮助系统。
- 启动 RFLP 解码程序。
- 点击 文件 > 打开 > XAD 文件。
此时将打开打开对话框。 - 选择包含限制性消化反应的 DNA 芯片对应的 XAD 文件，然后点击 打开。
系统将弹出一个对话框，列出芯片上加载的所有样本。 - 选择对应于一个 DNA 样本的三个消化反应，并使用酶列下方的下拉菜单为每个样本指定相应的限制性内切酶。在下图中，DNA 样本 1 已填写了酶列信息。
图 4。为每个样本指定限制性内切酶。 - 在标记为“min peak height as % of lower marker”的字段中，默认值为 10.0%。如有需要，可降低该值以识别之前遗漏的小峰，或提高该值以去除电泳图谱中非特异性噪声产生的峰。调整最小峰高数值后，请点击 Reintegrate（重新积分）。
图 5。设定最小峰高。 - 点击对话框底部的 Calc（计算） 按钮。
软件将自动填入从 Bioanalyzer 运行中获得的片段长度数据。 - 在屏幕左上角的 score（评分） 下拉列表中，选择适合数据分析的算法。若待分析的鱼类样本为单一鱼种，请在评分下拉列表中选择 Dice (Nei Li)；若样本可能为多种物种的混合物，则选择 Mixture（混合物）。
屏幕底部标记为 combined（合并） 评分的表格将列出基于三个消化反应结果的最佳物种匹配。表格中同时显示物种学名和常用名（见下图）。完全匹配（评分为 1）以绿色高亮显示；黄色高亮的匹配视为近似匹配。您可双击某一物种名称，以打开该物种的 FishBase 网页。
图 6。基于消化反应的物种鉴定。 - 在屏幕顶部的 lower cutoff（下限截断） 和 match tolerance（匹配容差） 字段中，可调整默认设置以优化最佳物种匹配的评分。lower cutoff 值用于排除短于设定长度的片段；match tolerance 值决定一个片段与预测片段在长度上需接近到何种程度才被视为匹配。
- 对同一芯片上的其余 DNA 样本，重复执行步骤 4 至 8。
8：代表性结果：
下图显示了来自4种不同鱼类物种的限制性消化样品的Bioanalyzer凝胶图像。阳性DNA样品的预期结果总结在下表中。
图7。限制性消化反应样品的Bioanalyzer凝胶图像。每条凝胶泳道均标注了该反应中所使用的限制性内切酶。
三文鱼阳性对照中预期的DNA片段大小
图 8．鲑鱼阳性对照中预期的 DNA 片段大小。
讨论
我们展示了一种基于DNA的简便、快速且准确的筛查方法，用于鉴定海产品中的鱼类物种。该方法强大高效，可在不到一个工作日内提供可重复且精确的结果，且由于其流程简化的实验方案和简单的设备要求，可广泛应用于商业检测机构。该方法通过生成客观数据进行分析，并利用RFLP Decoder软件对实验获得的鱼类物种图谱数据库（可扩展）进行比对分析。
通过常规实施，该检测方法有望防止海产品标签的错误标注，并有助于维护符合政府法规要求的准确记录。
披露
作者受雇于安捷伦科技公司，该公司生产本文所使用的试剂和仪器。
致谢
Agilent Stratagene 产品部
- Harini Ravi
- Natalia Novorodovskaya
- Scott Basehore
- Jeff Braman
- Rachel Formosa
- Ronda Allen
- Rajesh Bagga
- Derek Hall
- Sarah Jandle
- Danielle Huffman
- Robert Kincaid
- Mary McBride
- Nigel Skinner
- Juergen Schneider
- Stephen Mueller
- Martin Kratzmeier
- Steve Garrett
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Agilent 2100 生物分析仪（配备芯片预处理站和 IKA 涡旋混合器） | 安捷伦科技 | G2939AA | |
| 安捷伦 2100 生物分析仪笔记本电脑 &和专家软件 | 安捷伦科技 | G2953CA | G2950CA - 台式电脑 &和专家软件 |
| 安捷伦 Bioanalyzer DNA 1000 试剂盒（货号 #5067-1504） | 安捷伦科技 | 5067-1504 | |
| 热循环仪 | 各种 | 各种 | |
| PCR条形管 | 安捷伦科技 | 401428 | |
| PCR条板盖 | 安捷伦科技 | 401425 | |
| 96孔工作架 | 安捷伦科技 | 410094 | |
| 鱼类物种鉴定系统DNA提取试剂盒 | 安捷伦科技 | 联系 | |
| 鱼类物种鉴定系统 PCR-RFLP 试剂盒 | 安捷伦科技 | 联系 | |
| RFLP Matcher 软件 | 安捷伦科技 | 联系 | |
| 100% 乙醇，200 证明（USP 级或同等级别） | 各种 | 各种 | |
| 无菌、无核酸酶水 | 各种 | 各种 | |
| 移液器 | 各种 | 各种 | |
| 65℃的培养箱或水浴锅°C | 各种 | 各种 | |
| 无菌玻璃瓶或聚丙烯管（例如 14 ml BD Falcon 聚丙烯管） | 各种 | 各种 | |
| 圆底管或50 ml BD Falcon聚丙烯锥形管 | 各种 | 各种 | |
| 涡旋混合器 | 各种 | 各种 | |
| 微型离心机 | 各种 | 各种 | |
| 1.5 ml 微量离心管 | 各种 | 各种 | |
| 1.5 ml 离心管架 | 各种 | 各种 | |
| 移液器吸头 | 各种 | 各种 |
参考文献
- Dooley, J. J., Sage, H. D., Brown, H. M., Garrett, S. D. Improved fish species identification by use of lab-on-a-chip technology. Food Control. 16 (7), 601-607 (2004).
- Dooley, J. J., Sage, H. D., Clarke, M. -A. L., Brown, H. M., Garrett, S. D. Fish species Identification Using PCR-RFLP Analysis and Lab-on-a-Chip Capillary Electrophoresis: Application to Detect White Fish Species in Food Products and an Interlaboratory Study. J. Agric. Food Chem. 53, 3348-3357 (2005).
- Dooley, J., Garrett, S. Determination of PCR-RFLP Profiles for Fish Species Using the Agilent 2100 Bioanalyzer. Agilent Technologies Application Note. , (2005).
- Dooley, J. J., Clarke, M. L., Sage, H. D., Brown, H. M., Garrett, S. D. Application of a chip-based capillary electrophoresis system to enable simple PCR-RFLP identification of fish species. FSA Final Report Q01069. , (2004).
重印与许可
