对表达 SNAP-tag 融合蛋白的 COS-7 活细胞进行荧光标记以用于活细胞成像

摘要

SNAP-tag 和 CLIP-tag 蛋白质标记系统可实现包括荧光染料在内的多种分子与活细胞中目标蛋白的特异性共价结合。一旦完成克隆并表达，该标记蛋白即可与多种底物联合使用，适用于多种后续应用，而无需再次进行克隆。

摘要

SNAP-tag 和 CLIP-tag 蛋白标记系统可实现包括荧光染料在内的分子与活细胞中目标蛋白的特异性共价结合。这些系统提供了多种经过优化的荧光底物，适用于各类成像仪器。一旦完成克隆并表达，标记蛋白即可与多种底物联合用于多种下游应用，而无需重复克隆。该系统的使用包括两个步骤：将目标蛋白克隆并表达为 SNAP-tag 融合蛋白，以及使用所选的 SNAP-tag 底物对融合蛋白进行标记。SNAP-tag 是一种基于人源 O⁶-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶（hAGT），一种DNA修复蛋白。SNAP-tag标记物是通过苄基连接子与鸟嘌呤或氯嘧啶离去基团偶联的染料。在标记反应中，底物的取代苄基基团共价连接至SNAP-tag。CLIP-tag是SNAP-tag的改良版本，经改造后可与苄基胞嘧啶而非苄基鸟嘌呤衍生物发生反应。当与SNAP-tag联合使用时，CLIP-tag能够在同一细胞内实现两种蛋白质的正交且互补的标记。

方案

接种CHO-K1细胞：

1. 根据标准操作规程，将经胰蛋白酶消化的CHO-K1细胞50-100μl加入6ml完全F-12K培养基中。
2. 用移液器反复吹打数次以混匀细胞悬液，然后将300 μl消化后的细胞悬液分装至无菌8孔Lab-Tek II培养腔载玻片（#1.5硼硅酸盐玻璃腔室，Nalgene Nunc Int.；产品编号#155409；批号：100808-8-0）的每一孔中。
3. 将样品于37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。

使用 pSNAP-ADRB2 和 pSNAP-H2B 对 CHO-K1 细胞进行瞬时转染：

1. 检查前一天接种的细胞培养室，观察细胞密度和生长状态。
2. 标记相应数量的微量离心管。
3. 在超净台内，根据下表所示示例配制转染复合物混合液，每反应使用 0.3 μg pSNAP-ADBR2 对照质粒 DNA 或 0.3 μg pSNAP-H2B 对照质粒 DNA、1 μl TransPass D2 和 1 μl TransPass V。

   质粒	反应数	μl 无血清培养基	μl TransPass D2	μl TransPass V	μl 质粒 DNA	μl TransPass D2/反应	μl TransPass V/反应	ng DNA/反应	DNA 浓度 (ng/μl)	μl 质粒 DNA/反应
   SNAP-ADRb2	5	236.5	5	5	3.5	1	1	300	472.34	0.7
   H2B-SNAP	5	237	5	5	3	1	1	300	515.89	0.6
   Mock	5	240	5	5	0	1	1	0	0	0
   未转染	5	250	0	0	0	0	0	0	0	0

4. 首先将无血清 F-12K 培养基与适量质粒 DNA 混合，然后加入 TransPass D2 转染试剂，再加入 TransPass V 转染试剂。每次加入试剂后，轻轻吹打数次以充分混匀各组分。
5. 将反应液在室温下孵育 30 分钟。
6. 孵育期间，用 600 μl 完全 DMEM 培养基洗涤细胞一次，并向每个样品中加入 450 μl 完全 DMEM 培养基。
7. 将 50 μl 转染复合物混合液缓慢逐滴加入每个样品中。
8. 将样品在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育过夜。

使用 pSNAP-ADRB2 和 pSNAP-H2B 瞬时转染的 CHO-K1 细胞的 SNAP-Cell TMR Star 标记：

1. 用真空抽吸小心移除各样品中的转染复合物培养基。用 600 μl 完全 F-12K 培养基洗涤细胞两次，并向每孔中更换 600 μl 完全 F-12K 培养基。
2. 通过加入 995 μl 完全 F-12K 培养基和 51 μl 0.6 mM SNAP-Cell TMR-Star 底物来配制染料标记培养基。SNAP-Cell TMR-Star 的终浓度应为 3 mM。加入底物后，反复吹打混匀数次。
3. 小心移除样品中的生长培养基，并向每孔中加入 200 μl 染料标记培养基。将样品在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 30 分钟。
4. 在样品孵育期间，通过将 1 μl Hoechst 33342 三盐酸盐三水合物（10 mg/ml 水溶液，16.2 mM 溶液；Invitrogen Molecular Probes）加入 10 ml 完全 F-12K 培养基中，配制用于样品核染色的 Hoechst 33342 溶液。
5. 移除所有样品中的培养基，并向每个样品中加入 600 μl 稀释的 Hoechst 溶液。将样品在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 5 分钟。
6. 用 600 μl 完全 F-12K 培养基洗涤样品三次。
7. 将样品在 37°C、5% CO₂ 条件下继续孵育额外 30 分钟，以使未结合的荧光染料从细胞中扩散出去。
8. 30 分钟后，最后一次更换 SNAP-Cell 样品的培养基，然后进行成像。
9. 使用 Zeiss Apotome Axiovert 200M 荧光显微镜对细胞进行成像。

代表性结果

图1. 本图展示了使用标准荧光显微镜对活体COS-7细胞进行荧光成像的一些代表性结果，这些细胞表达SNAP-tag融合蛋白。第一张图像显示的是表达pSNAP-H2B（核组蛋白）的活体COS-7细胞，用SNAP-Cell TMR-Star标记。pSNAP-H2B构建体是使用pSNAP-tag(m)载体构建的。细胞用SNAP-Cell TMR-Star标记30分钟，并用Hoechst 33342（蓝色）对细胞核进行复染。粉红色荧光显示了组蛋白蛋白所在区域的红色荧光与指示细胞核的蓝色荧光的叠加信号。H2B蛋白的表达清晰且易于识别。

图 2 和图 3。 接下来的这两幅图像显示了瞬时转染 pSNAP-ADRβ2 的活体 COS-7 细胞。
细胞用 SNAP-Cell TMR-Star（红色）标记，并用 Hoechst 33342（蓝色）复染。pSNAP-ADRβ2 质粒构建体是使用 pSNAP-tag(m) 载体构建的。细胞用 SNAP-Cell TMR-Star 标记 30 分钟，并用 Hoechst 33342（蓝色）复染以标记细胞核。红色荧光表示细胞表面受体蛋白 ADRB2 的存在，蓝色荧光标识细胞核。

讨论

影响观察结果的变量有多种，例如聚焦、激光强度、设备性能、所用镜头等。荧光染料的光稳定性决定了在荧光衰减之前必须以多快速度完成采集。

该蛋白质标记方法具有广泛的适用性，可用于多种应用场景。SNAP-tag和CLIP-tag技术可实现融合蛋白与合成探针的特异性标记，从而研究蛋白质功能的多个方面，包括活细胞及细胞裂解液中的多种动态过程。SNAP-、CLIP-、MCP-和ACP-tag技术为活细胞和固定细胞中蛋白质的成像以及蛋白质功能的研究提供了简便性和极高的灵活性。 在 体外单个基因构建体的创建可产生一种带标签的融合蛋白，该蛋白能够与多种功能基团（包括荧光染料、生物素或微珠）形成共价连接。目的蛋白只需克隆并表达一次，其融合产物即可与多种荧光底物联用，适用于多种下游应用，例如活细胞内同时标记蛋白、蛋白定位与转位、脉冲-追踪实验、受体内部化研究、细胞表面选择性标记、蛋白下拉实验、SDS-PAGE中的蛋白检测、流式细胞术、微孔板中的高通量结合实验、生物传感器相互作用实验以及基于FRET的结合实验。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CHO-K1 细胞	ATCC	CCL-61
无血清 F-12K 培养基
带 #1.5 硼硅酸盐盖玻片腔室的 Lab-Tek II 腔室载玻片	Nalge Nunc International	155409	批号: 100808-8-0
DMEM 培养基
H–chst 33342，三盐酸盐三水合物（水中 10 mg/ml 溶液，16.2 mM 溶液）	Invitrogen	H3570	470519
Zeiss Apotome Axiovert 200M 荧光显微镜	Carl Zeiss, Inc.
Transpass V	新英格兰生物实验室（New England Biolabs）	M2561S	0030709
Transpass D2	新英格兰生物实验室（New England Biolabs）	M2554S	0060802
SNAP-Cell TMR Star	新英格兰生物实验室（New England Biolabs）	S9105S	0010811
pSNAP-ADBR2 对照质粒	新英格兰生物实验室（New England Biolabs）	N9178S	0010811
pSNAP-H2B 对照质粒	新英格兰生物实验室（New England Biolabs）	N9179S	0010811