阿尔茨海默病的一个特征是Aβ1-42肽水平升高。本文提供了一种合成Aβ1-42寡聚体的实验方案，该寡聚体可损害海马区的长时程增强作用（Long-Term Potentiation），而后者是记忆的细胞学基础。该方法可用于研究Aβ诱导的病理机制以及药物筛选。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
突触连接的损伤可能是阿尔茨海默病（AD）早期出现轻微遗忘性改变的基础。β-淀粉样蛋白（Aβ）是一种在AD中大量产生的多肽，已知其可降低长时程增强（LTP），而LTP是学习与记忆的细胞学基础。事实上，由Aβ引起的LTP损伤是研究AD模型中突触功能障碍以及筛选能够缓解或逆转此类突触损伤药物的有效实验范式。研究表明，Aβ主要通过其寡聚体形式导致LTP的破坏。本文提供了一种详细的实验方案，通过将合成的Aβ1-42寡聚体肽灌注至急性海马脑片上，以诱导LTP损伤。在本视频中，我们概述了制备寡聚化Aβ的逐步操作流程。1-42。然后，我们追踪一个单独的实验，在该实验中，暴露于寡聚化 Aβ 的海马脑片中的长时程增强（LTP）受到抑制1-42与对照组实验中未添加 Aβ 的切片相比1-42暴露已经发生。
方案
重悬β-淀粉样肽
开始之前，请准备好以下物品：
- Aβ1-42（冻干粉末）
- 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP）
- 低吸附聚丙烯微量离心管（1.5 ml）
- 带聚四氟乙烯推杆止动装置的气密型汉密尔顿注射器（250 μl）
- 二甲基亚砜（DMSO）
- 将冻干的 Aβ1-42 在室温下平衡 30 分钟，以避免打开肽管时产生冷凝水。
- 在通风橱内，用冰冻的 HFIP 重新悬浮 Aβ1-42 肽，配制成 1 mM 溶液，并涡旋数秒。
- 使用带有聚四氟乙烯（Teflon）塞的玻璃气密型 Hamilton 注射器，迅速将 Aβ1-42/HFIP 溶液均等地分装至三个聚丙烯管中，并密封管子。
- 将管子在室温下孵育 2 小时，以促进 Aβ 单体化。随后打开管子，使用真空离心浓缩仪（SpeedVac 离心机，800 g，室温）对 Aβ1-42/HFIP 溶液进行浓缩，直至管底出现透明的肽膜。需仔细监控 SpeedVac 离心机内的温度，避免肽降解（最高不超过 25°C）。
- 密封管子，并将分装样品在 -80°C 下保存。Aβ 膜可在 -80°C 下稳定保存 6 ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
如上所述，寡聚化Aβ制备过程中的若干问题可能导致LTP未受损害。评估Aβ是否发生降解或未能成功寡聚化的一种方法是采用TRIS-Tricine PAGE/Western Blotting分析及分析型超速离心（本方案未描述）对Aβ样品进行检测。当Western Blotting样品在非变性、非还原条件下制备时，成功的Aβ制备应产生包含单体及不同寡聚体对应条带的Western Blotting特征图谱3一个常见问题是肽在SpeedVac浓缩仪干燥步骤中的不稳定性。事实上，高温干燥会导致蛋白质降解，表现为肽溶液明显变为棕色。HFIP溶液的浓缩必须在室温下进行，并密切监控。由于该实验方案包含多个操作步骤，稀释过程中的误差可能意外导致寡聚化效果不佳或Aβ浓度测定结果产生误导。有趣的是，若灌注的Aβ浓度低于建议值，则会导致LTP值升高。3灌流方式同样会影响Aβ处理脑片后的可能结果。事实上，在我们的电生理实验中，维持浴液温度恒定至关重要，因为已知在磷酸盐缓冲液中溶解时，温度会影响Aβ的构象。另一个值得关注的问题是，寡聚态Aβ可能非特异性地吸附于配制和灌流过程中所用容器及管路的塑料表面，从而降低实际作用于海马脑.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
动物实验按照哥伦比亚大学动物护理和使用委员会（IACUC）制定的指南和规定进行。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）国家神经疾病与卒中研究所（NINDS）（NS049442）资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Aβ 1-42（冻干粉） | American Peptide | 62-0-80 | |
| 1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇（HFIP） | Fluka | 52517 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Biotium, Inc. | 90082 | |
| 50 mL 聚丙烯离心管 | Corning | 05-538-67 | |
| 1.5 mL MaxyClear 微量离心管（最大回收率） | Axygen Scientific | MCT-150-L-C | |
| 磷酸盐缓冲液，pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| GASTIGHT 注射器，250 μL | Hamilton Co | 1725 | |
| 水浴超声仪 | Branson | 3510 | |
| Savant SpeedVac 浓缩系统 | Various | SC 110A |
参考文献
- Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278, 11612-11622 (2003).
- Vitolo, O. V.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
