制备寡聚态β-淀粉样蛋白1-42并诱导海马脑片突触可塑性损伤

摘要

阿尔茨海默病的一个特征是Aβ_1-42肽水平升高。本文提供了一种合成Aβ_1-42寡聚体的实验方案，该寡聚体可损害海马区的长时程增强作用（Long-Term Potentiation），而后者是记忆的细胞学基础。该方法可用于研究Aβ诱导的病理机制以及药物筛选。

摘要

突触连接的损伤可能是阿尔茨海默病（AD）早期出现轻微遗忘性改变的基础。β-淀粉样蛋白（Aβ）是一种在AD中大量产生的多肽，已知其可降低长时程增强（LTP），而LTP是学习与记忆的细胞学基础。事实上，由Aβ引起的LTP损伤是研究AD模型中突触功能障碍以及筛选能够缓解或逆转此类突触损伤药物的有效实验范式。研究表明，Aβ主要通过其寡聚体形式导致LTP的破坏。本文提供了一种详细的实验方案，通过将合成的Aβ1-42寡聚体肽灌注至急性海马脑片上，以诱导LTP损伤。在本视频中，我们概述了制备寡聚化Aβ的逐步操作流程。_1-42。然后，我们追踪一个单独的实验，在该实验中，暴露于寡聚化 Aβ 的海马脑片中的长时程增强（LTP）受到抑制_1-42与对照组实验中未添加 Aβ 的切片相比_1-42暴露已经发生。

方案

重悬β-淀粉样肽

开始之前，请准备好以下物品：

• Aβ_1-42（冻干粉末）
• 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP）
• 低吸附聚丙烯微量离心管（1.5 ml）
• 带聚四氟乙烯推杆止动装置的气密型汉密尔顿注射器（250 μl）
• 二甲基亚砜（DMSO）

1. 将冻干的 Aβ_1-42 在室温下平衡 30 分钟，以避免打开肽管时产生冷凝水。
2. 在通风橱内，用冰冻的 HFIP 重新悬浮 Aβ_1-42 肽，配制成 1 mM 溶液，并涡旋数秒。
3. 使用带有聚四氟乙烯（Teflon）塞的玻璃气密型 Hamilton 注射器，迅速将 Aβ_1-42/HFIP 溶液均等地分装至三个聚丙烯管中，并密封管子。
4. 将管子在室温下孵育 2 小时，以促进 Aβ 单体化。随后打开管子，使用真空离心浓缩仪（SpeedVac 离心机，800 g，室温）对 Aβ_1-42/HFIP 溶液进行浓缩，直至管底出现透明的肽膜。需仔细监控 SpeedVac 离心机内的温度，避免肽降解（最高不超过 25°C）。
5. 密封管子，并将分装样品在 -80°C 下保存。Aβ 膜可在 -80°C 下稳定保存 6 个月。
6. 加入 DMSO 溶解一份肽膜，使 Aβ_1-42 浓度达到 5 mM。在水浴中超声处理 10 分钟，以确保完全重新悬浮。
7. 将该 5 mM Aβ_1-42 溶液分装至聚丙烯管中。密封所有管子，并在 -20°C 下保存。分装样品仅可解冻一次。注意避免冰箱内产生水汽冷凝。溶液状态的肽极易降解。

寡聚化

开始之前，请准备好以下物品：

• Aβ_1-42/DMSO (5 mM)
• 无菌磷酸盐缓冲液
• 低吸附聚丙烯微量离心管（1.5 ml）
• 低吸附聚丙烯离心管（50 ml）

1. 将获得的5 mM Aβ_1-42/DMSO等份样品用无菌磷酸盐缓冲液稀释至100 μl。
2. 涡旋振荡30秒，然后在4°C孵育12小时。

海马脑片处理

在处理海马脑片时，应避免多肽非特异性地黏附于烧杯、灌流管表面以及记录室。建议优先使用低吸附性的聚丙烯管路和容器，避免使用玻璃器皿或普通塑料器皿。灌流液应不含血清或白蛋白。

Aβ灌流

开始之前，请准备好以下物品：

• 寡聚化 Aβ_1-42
• 记录缓冲液（单位：mM，含 124 NaCl、4.4 KCl、1 Na₂HPO₄、25 NaHCO₃、2 CaCl₂、2 MgCl₂ 和 10 葡萄糖）
• 配备界面式记录室的电生理记录装置
• 横切海马脑片在含氧记录缓冲液中孵育，解剖后至少孵育 90 分钟（温度 = 29°C；持续灌流速度 = 2 ml/分钟）

1. 实验前立即在聚丙烯管中用预先充氧的记录缓冲液将寡聚化的 Aβ_1-42 分装样品稀释至适当的工作浓度（200 nM 或更高）。
2. 在诱导突触可塑性之前，将 Aβ_1-42 溶液灌流至脑片持续 20 分钟。

诱导可塑性及随访

1. 通常，突触可塑性最常用的模型是长时程增强（LTP）。可通过海马中特定突触的强直刺激诱导LTP。我们记录来自Schaffer侧支投射与辐射层中CA1锥体神经元之间突触的场反应。我们的强直刺激采用θ节律爆发刺激，包括3组刺激串，每组间隔15秒。每组刺激串包含10个5 Hz的爆发，每个爆发包含5个100 Hz的脉冲。在完成寡聚化Aβ灌注后，立即施加强直刺激。
2. 强直刺激结束后，立即切换回正常记录液的灌注。在整个实验过程中，保持恒定的灌注速率、记录室温度以及充分的氧合状态。

代表性结果与可能遇到的问题

Aβ 按照 Stine 等人报道的经典方案进行寡聚化。¹，生成Aβ单体以及多种不同大小的寡聚体（二聚体、三聚体等）。寡聚化Aβ的灌注_1-42 导致经Aβ处理的脑片中LTP较对照组脑片降低。在本实验条件下，使用3-5月龄C57BL/6J雄性小鼠，经200 nM Aβ处理的脑片在强直刺激后两小时的LTP平均为基线值的150%，而对照组脑片的LTP平均为基线值的200-250%2。在某些情况下，Aβ处理可能未能降低海马LTP。可能出现的若干关键错误包括Aβ浓缩过程中薄膜过度干燥以及寡聚化不完全。由于Aβ肽在溶液中的理化特性易与塑料材料发生非特异性吸附，因此在海马脑片中进行Aβ灌流也可能存在问题。上述问题的解决方案将在下文讨论。

讨论

如上所述，寡聚化Aβ制备过程中的若干问题可能导致LTP未受损害。评估Aβ是否发生降解或未能成功寡聚化的一种方法是采用TRIS-Tricine PAGE/Western Blotting分析及分析型超速离心（本方案未描述）对Aβ样品进行检测。当Western Blotting样品在非变性、非还原条件下制备时，成功的Aβ制备应产生包含单体及不同寡聚体对应条带的Western Blotting特征图谱³一个常见问题是肽在SpeedVac浓缩仪干燥步骤中的不稳定性。事实上，高温干燥会导致蛋白质降解，表现为肽溶液明显变为棕色。HFIP溶液的浓缩必须在室温下进行，并密切监控。由于该实验方案包含多个操作步骤，稀释过程中的误差可能意外导致寡聚化效果不佳或Aβ浓度测定结果产生误导。有趣的是，若灌注的Aβ浓度低于建议值，则会导致LTP值升高。³灌流方式同样会影响Aβ处理脑片后的可能结果。事实上，在我们的电生理实验中，维持浴液温度恒定至关重要，因为已知在磷酸盐缓冲液中溶解时，温度会影响Aβ的构象。另一个值得关注的问题是，寡聚态Aβ可能非特异性地吸附于配制和灌流过程中所用容器及管路的塑料表面，从而降低实际作用于海马脑...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Aβ 1-42（冻干粉）	American Peptide	62-0-80
1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇（HFIP）	Fluka	52517
二甲基亚砜（DMSO）	Biotium, Inc.	90082
50 mL 聚丙烯离心管	Corning	05-538-67
1.5 mL MaxyClear 微量离心管（最大回收率）	Axygen Scientific	MCT-150-L-C
磷酸盐缓冲液，pH 7.4	Invitrogen	10010-023
GASTIGHT 注射器，250 μL	Hamilton Co	1725
水浴超声仪	Branson	3510
Savant SpeedVac 浓缩系统	Various	SC 110A