斑马鱼化学筛选的自动化成像与分析方法开发

摘要

我们报道了一种用于多孔板中转基因斑马鱼胚胎自动成像与分析系统的开发。该系统展示了测量小分子BCI对成纤维细胞生长因子报告基因表达的剂量依赖性效应的能力，并为建立高通量斑马鱼化学筛选技术提供了支持。

摘要

我们展示了基于图像的高内涵筛选（HCS）方法在斑马鱼胚胎中用于鉴定可调控 FGF/RAS/MAPK 信号通路的小分子化合物。斑马鱼胚胎是体内高内涵化学筛选的理想体系。出生后1天的胚胎直径约为1毫米，可轻松排列至96孔板中，这是高通量筛选的标准格式。在发育的最初一天内，胚胎呈透明状态，大多数主要器官均已形成，因而能够直观观察胚胎发育过程中的组织形成。然而，斑马鱼化学筛选的完全自动化仍面临挑战，尤其是在自动图像采集与分析方面。我们此前构建了一种转基因报告品系，该品系在FGF活性调控下表达绿色荧光蛋白（GFP），并已证实其在化学筛选中的应用价值。¹为了建立高通量全生物体筛选的方法学，我们开发了一套系统，可对受精后24-48小时（hpf）的斑马鱼胚胎在96孔板中进行自动成像与分析。²在本视频中，我们重点介绍在受精后24小时将转基因胚胎排列至多孔板中的操作步骤，以及添加一种可增强FGF信号通路活性的小分子化合物（BCI）的方法。³. 将培养皿孵育6小时，随后加入三卡因以麻醉幼鱼，然后在Molecular Devices ImageXpress Ultra激光扫描共聚焦HCS读取仪上进行自动成像。使用我们开发的基于Definiens Developer软件的认知网络技术算法对图像进行处理，以检测和量化转基因胚胎头部中GFP的表达。在本示例中，我们重点展示了该算法测量BCI处理胚胎中GFP报告基因表达剂量依赖性效应的能力。

方案

1）设置斑马鱼交配及 BCI 处理。

1. 治疗前两天，鉴定纯合子雄性 Tg(dusp6:d2eGFP)^pt6 斑马鱼，分别放入交配用鱼缸中¹加入隔离板，并放入一条野生型 AB* 雌性鱼，置于交配笼中过夜。
2. 次日早晨移除分隔器，1小时后收集胚胎。将胚胎转移至含E3溶液（5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4）的100 mm培养皿中，于28°C孵育6小时。去除死亡及未受精的胚胎，加入新鲜E3溶液，继续孵育过夜。
3. 挑选处于相似发育阶段（24 hpf）且GFP表达均匀的转基因胚胎。将胚胎逐个排列至96孔板的各个孔中。
4. 用移液器吸除多余的E3溶液。使用多通道移液器向每孔加入200μl E3溶液。
5. 按所列顺序加入以下化合物：
   
   

   1

   2

   3

   4

   5

   6

   7

   8

   9

   10

   11

   12

   A

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1 mM)

   2 μl BCl (0.5 mM)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5 mM)

   2μl BCl (0.1 mM)

   2μl BCl (0.5 mM)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5 mM)

   2μl DMSO

   B

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1 mM)

   2μl BCl (0.5 mM)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5 mM)

   2μl BCl (0.1 mM)

   2μl BCl (0.5 mM)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5 mM)

   2μl DMSO

   C

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1 mM)

   2μl BCl (0.5 mM)

   2μl BCl (1 mM)

   2 μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5 mM)

   2μl BCl (0.1 mM)

   2μl BCl (0.5 mM)

   2 μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5 mM)

   2μl DMSO

   D

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1 mM)

   2μl BCl (0.5 mM)

   2 μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5 mM)

   2μl BCl (0.1 mM)

   2μl BCl (0.5 mM)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5 mM)

   2μl DMSO

   E

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1 mM)

   2μl BCl (0.5 mM)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5 mM)

   2μl BCl (0.1 mM)

   2μl BCl (0.5 mM)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5 mM)

   2μl DMSO

   F

   2μl DMSO

   2 μl BCl (0.1 mM)

   2μl BCl (0.5 mM)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5 mM)

   2μl BCl (0.1 mM)

   2μl BCl (0.5 mM)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5 mM)

   2μl DMSO

   G

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1 mM)

   2μl BCl (0.5 mM)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5 mM)

   2μl BCl (0.1 mM)

   2μl BCl (0.5 mM)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5 mM)

   2μl DMSO

   H

   2μl DMSO

   2μl BCl (0.1 mM)

   2μl BCl (0.5 mM)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5 mM)

   2μl BCl (0.1 mM)

   2μl BCl (0.5 mM)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5 mM)

   2μl DMSO

   终浓度分别为1μM、5μM、10μM、20μM、25μM BCI，溶剂为1% DMSO。用铝箔包裹培养板，于28°C孵育6小时。

2）96孔板的自动化成像与分析。

1. 向每个孔中加入 10μl 三卡因（0.61mM），以麻醉 30 小时受精龄（30hpf）的胚胎。
2. 将培养板装入 Molecular Devices Imagexpress Ultra 仪器中。
3. 打开 Metaxpress 软件。选择配置为 4 倍物镜和最大针孔直径的设置，将激光自动对焦配置为检测培养板底部，并确定用于检测感兴趣区域的最佳 Z 平面。在 488/525 nm（GFP）的激发/发射波长下采集图像。将扫描区域设置为单个位点，大小为 2000×2000 像素（4×4 mm），无像素合并。调节激光功率和增益，使阳性对照图像中最亮区域不发生信号饱和。在多个阳性和阴性对照孔中确认图像采集正常。
4. 开始培养板扫描。仪器将自动从所有孔中采集图像，并将其归档至 SQL 服务器数据库中。
5. 使用 Definiens Developer 中的 Cellenger 应用模块，以及能够识别 Molecular Devices Imagexpress Ultra 平台生成的图像格式和文件结构的导入滤镜，将图像上传至 Definiens Developer。
6. 使用自定义设计的认知网络技术算法（亦称规则集）处理图像。该算法基于近期发表的规则集²进行自主开发，旨在自动识别胚胎、卵黄和头部，并量化表达 GFP 的头部结构的亮度和面积。对于未检测到胚胎的孔，或头部无法明确识别的孔（例如因化合物毒性过高或图像失焦），将从分析中排除。使用若干阴性对照图像（溶剂处理）和阳性对照图像（BCI 处理）对算法进行配置，确保在两种情况下均能正确识别头部和卵黄。将“头部结构”检测阈值设为卵黄平均强度的倍数，直至亮部头部结构的检测结果与肉眼观察一致。定义需导出的参数。在本示例中，最具信息量的参数是头部内 GFP 阳性区域的总积分亮度，以下简称“头部结构总亮度”（图 1）。
   
   
   图 1
   图示 BCI 对转基因胚胎中 GFP 表达的剂量依赖性效应。
7. 使用集成的作业调度器对所有培养板图像运行该算法。Definiens 软件采用多处理器（“引擎”）的分布式计算，可同时分析多幅图像。算法根据图像分析结果计算数值指标，并将这些数据连同已应用分析的处理后图像副本一并保存至数据库中。

代表性结果：

所有图像分析完成后，数据可在 Cellenger 内进行可视化，或导出至第三方软件（如 Excel、GraphPad Prism）以进行进一步分析和图形呈现。图2展示了经溶剂处理和BCI处理的孔中存档的扫描图像，分别显示了应用与未应用CNT分析的结果。图1记录了BCI对Tg(dusp6:d2EGFP)^pt6胚胎中GFP报告基因表达的剂量依赖性效应。引发半数最大反应（EC50）所需的浓度约为12 μM。


图2
转基因斑马鱼胚胎的自动图像采集与分析。（A）30小时受精后（30hpf）经DMSO溶剂处理的Tg(dusp6:d2eGFP)^pt6胚胎。（B）经20μM BCI处理的转基因胚胎显示出GFP表达增加。（C）对（A）中胚胎应用Definiens规则集后得到的图像，用于检测头部的GFP表达。橙色斑点表示软件测量GFP强度的位置。（D）对（B）中胚胎应用Definiens规则集后得到的图像，橙色斑点表示软件测量GFP强度的位置。请注意，该规则集能够识别出经处理胚胎中GFP表达区域的扩展。

讨论

限制斑马鱼化学筛选通量的一个主要因素是缺乏系统处理96孔板以进行成像和分析的方法。由于多细胞生物体的图像本身具有复杂性、低对比度和异质性，现有的图像分析算法无法有效识别和量化生物体内的特定结构。因此，大多数已发表的斑马鱼化学筛选都需要专门人员在整个实验过程中对每个孔进行目视检查。这种方法通常导致无法生成数值型读数，也无法完整归档筛选图像和数据。此外，人工评估排除了基于图像筛选的若干关键优势，包括能够对筛选结果进行回顾性分析、能够考察在筛选过程中并非主要关注的表型变化（例如毒性或发育缺陷），以及能够使用相同的化合物库将筛选数据与过去或未来的筛选结果进行交叉比对。

本报告中，我们重点介绍了一种无需人工干预即可对多孔板中的斑马鱼胚胎进行自动成像与分析的方法。我们利用 ImageXpress Ultra 激光扫描共聚焦读板仪（Molecular Devices，Sunnyvale，CA）实现了对 96 孔板中 Tg(dusp6:d2EGFP)^pt6 胚胎的自动图像采集，并基于 Definiens 的认知网络技术开发了一种图像分析算法，用于定量分析转基因胚胎头部的 GFP 表达。该方法能够提供梯度响应结果，并量化小分子 FGF 信号通路激活剂在体内的活性。类似结果也通过基于落射荧光的 ArrayScan II（Cellomics Inc.，Pittsburgh，PA）获得，表明可在多种市售的读板仪上实现对斑马鱼胚胎的自动图像采集²。自动分析多细胞生物图像的方法的建立，消除了对人工视觉评分的依赖，实现了数值数据与图像的生成及归档，便于后续回顾性分析以及与未来筛选结果的比较。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
三卡因（MS222）	Sigma-Aldrich	货号 # A-5040