同步进行啮齿类动物脑部的fMRI与电生理记录

摘要

我们开发了一种在啮齿类动物大脑中同时进行功能性磁共振成像和电生理记录的方法，为研究神经活动与血氧水平依赖性（BOLD）磁共振成像信号之间的关系提供了平台。

摘要

为了研究血氧水平依赖性（BOLD）磁共振成像（MRI）信号的神经基础，我们建立了一种啮齿类动物模型，在该模型中可获取功能磁共振成像数据以及in vivo可在同一时间进行皮层内记录。由于记录所用的电极会扭曲磁共振成像（MRI）图像，而MRI采集过程会在电生理记录中引入噪声，因此将MRI与电生理记录相结合在技术上具有挑战性。为最大限度减少两种模态之间的相互干扰，本研究采用玻璃微电极而非金属电极，并对电生理数据实施了噪声去除算法。在我们的研究中，将两根微电极分别植入大鼠双侧初级躯体感觉皮层（SI），并固定于原位。选择一个包含电极尖端的冠状切片进行功能磁共振成像（fMRI）。电极杆体及固定位置未被包含在成像切片内，以避免产生成像伪影。移除的头皮被牙膏替代，以减少磁化率失配，防止图像中出现吉布斯振铃伪影。在图像采集期间，快速切换的磁场在电生理记录中引起的伪影结构通过平均每次运行中所有扫描周期来表征。随后，将成像期间的噪声结构从原始记录中减去。去噪后的时间序列数据随后与fMRI数据结合用于进一步分析。例如，该同步采集方法被用于确定自发性fMRI血氧水平依赖（BOLD）信号与频带限制性皮层内电活动之间的关系。在啮齿类动物中实现fMRI与电生理记录的同步采集，将为神经科学领域的众多激动人心的应用提供平台，同时有助于阐明fMRI BOLD信号与神经元活动之间的关系。

方案

1. 这是一种非存活性手术。第一步是植入电极。在此示例中，电极将被植入双侧大脑半球初级体感皮层的前肢区域。

1. 使用2%异氟烷麻醉大鼠（雄性SD大鼠，200–300 g），并将其固定在立体定位手术系统上。手术开始前，确保动物已充分麻醉，对脚趾夹捏无反应。在切开头皮前去除毛发。分离颅骨上方的肌肉和其他组织，并使用电灼器阻断骨表面的任何出血。
2. 在颅骨表面（靠近中线前部V形交界处）制备一个柱状突起，作为植入电极杆的固定点，使用牙科水泥进行固定。在涂抹牙科水泥前，将一颗小型尼龙螺钉植入骨内，可增强稳定性。用水泥制成的柱状突起底部面积约为3 × 5 mm²，高度约5 mm（见图1）。
3. 使用尖端精细的电动钻小心打开颅骨，暴露双侧大脑半球初级躯体感觉皮层前爪代表区的硬脑膜。每个钻孔直径约为1 mm，位置位于前囟前1 mm、外侧4 mm处。在显微镜下，用注射器针尖在硬脑膜上切开一个微小开口，注意避免损伤任何血管。
4. 在插入每个电极前，确保切口附近无出血或渗出。玻璃微电极应在术前制备，杆长约为3~4 cm，阻抗为1~5 Mω。用电极毛细管充入人工脑脊液（ACSF），并通过立体定位臂将电极以约45°角（从后向前）倾斜插入脑组织，插入深度约为硬脑膜开口下方0.4 mm。在固定前检查电信号。将一根氯化银丝的一端浸入ACSF中，另一端连接至放大器输入导线。另一根银丝埋置于切开皮肤的皮下，作为参考电极。
5. 在固定电极前，再次检查手术区域，确保无出血或渗出，然后使用牙膏状物质填补被移除的皮肤和肌肉空隙，覆盖颅骨缺损区域。使用该牙膏状物质可通过减少颅骨/空气界面的磁化率失配，从而提高磁共振成像质量。用电科水泥将电极杆固定在预先制备的柱状突起上（见图1）。
6. 待牙科水泥固化后，将动物转移至MRI扫描床并固定。在整个实验过程中持续监测大鼠的生理状态，包括体温、呼吸频率、SPO₂和心率。
7. 将表面线圈（发射/接收线圈）置于头部上方，使电极从线圈中心穿出。扫描床上方另设一个拱形硬质盖板，用于固定电极导线，防止动物呼吸运动引起位移。用于同步成像与记录的导线延伸至约5 m（放大器位于磁体室外），并包裹导电塑料，作为被动屏蔽层。
8. 如需减少对神经活动的抑制，可将麻醉剂由异氟烷更换为美托咪啶。在将动物送入磁体前，最后检查一次电信号。在本研究中，记录参数如下：放大倍数×1000，带通滤波0.1 Hz~5 kHz，60 Hz陷波滤波，模数转换采样率为12 kHz。

2. 此时，将动物放入磁共振成像仪中进行同步成像和记录。在整个成像过程中，动物均处于麻醉状态。

1. 本研究使用了一台9.4 T的小动物MRI系统（Bruker，德国）。在开始扫描前，必须设定成像参数。采用三平面定位像来确定fMRI扫描的位置。为提高磁场的均匀性，使用FASTMAP¹对感兴趣区域进行匀场。在fMRI研究中，选择包含双侧前爪初级躯体感觉区的冠状面成像切片，电极即植入于该区域。EPI成像参数如下：视野（FOV），1.92 × 1.92 cm²；矩阵大小，64 × 64；面内分辨率，0.3 × 0.3 mm²；层厚，2 mm；TR/TE，500/15 ms。
2. 完成成像设置后，即可开始同步记录与fMRI扫描。图2展示了成像过程中具有代表性的EPI图像及原始电生理记录。在图像采集期间，梯度磁场的快速切换会导致记录信号饱和，但这种饱和仅持续每个扫描周期的一小部分时间（22/500 ms）。图像采集结束后，电信号以非饱和振荡的形式恢复至基线水平（见图3）。联合fMRI与电生理记录可在静息态（如本研究所示）或刺激状态下进行。在刺激实验中，成像参数与静息态研究相同，前爪电刺激参数为9 Hz、1~4 mA电流。最后一次扫描完成后，处死大鼠。

3. 同时成像和记录后，数据必须在最终分析之前进行预处理。

1. 首先从电生理记录中去除梯度伪影（见图3）。
   1. 通过平均所有约500毫秒（TR）的片段来提取由扫描引起的噪声结构，每个片段对应于两幅连续fMRI图像之间的时间间隔。
   2. 从原始记录中减去平均噪声结构。该方法仅校正未饱和的记录片段。
   3. 每个在图像采集期间因梯度切换而导致饱和的片段，均被一条连接梯度引起饱和前和饱和后时间点的直线所替代。
2. 随后将去噪后的局部场电位（LFPs）记录转换为功率时间序列，其时间分辨率与fMRI时间序列相同。计算最低频率（delta频段，1~4 Hz）时采用2秒时间窗的平均功率，theta频段（4~8 Hz）使用1秒时间窗，而更高频率（> 8 Hz，alpha至gamma频段）则采用相邻饱和信号之间约0.5秒的时间窗。所有频率带的滑动窗均以0.5秒为步长移动，与fMRI数据的TR相匹配。
3. 对于图像数据，执行标准的fMRI预处理步骤，包括头动校正、使用0.5 mm FWHM进行图像平滑处理以及线性漂移去除。
4. 在LFP功率时间序列与成像数据每个体素的时间序列之间进行互相关分析。通过引入不同的时间滞后，可考察时间依赖性相关关系（见图4）。

代表性结果：

例如，该技术可用于研究自发性神经活动与BOLD信号波动之间的关系。图4显示了从一只大鼠获得的LFP功率与BOLD信号在-2.5至9.5秒时间延迟范围内的相关性图谱。电极尖端附近皮层区域的低频BOLD波动（< 0.1 Hz）与LFP功率变化（< 0.1 Hz）在2~6秒的延迟下呈现相关性。

图1. 电极植入及使用表面线圈进行成像区域的示意图。

图 2. 左侧面板显示包含电极尖端的一个代表性冠状面 EPI 图像。右侧面板显示成像前和成像期间的原始电生理记录。

图3. 通过放大单个扫描周期可以发现，成像期间的伪迹（绿色）可从原始记录信号（蓝色）中去除。去噪后的时间序列（红色）用于后续分析。

图 4. 相关性冠状面图（来自一只典型大鼠），显示一个电极记录的自发 delta 频段活动功率与不同时间滞后（-2.5 至 9.5 s）下的静息态 BOLD 信号之间的相关性。在异氟烷麻醉大鼠中，双侧 SI 区约 4~5 s 时观察到最大相关性。颜色条表示 Pearson 相关系数 r。

讨论

电生理记录和BOLD fMRI各自都是发展成熟的技术。然而，由于这两种模态之间存在相互干扰²，同时进行记录与成像具有挑战性。本文提出了一种在啮齿类动物中开展联合实验的可行方案。改进后的电极植入方法可最大程度减少对图像质量的影响，同时必须对电生理记录信号进行伪迹去除，以消除图像采集过程中引入的噪声。在啮齿类动物中实现同步成像与记录，将为研究自发神经活动与BOLD信号之间的耦合关系提供一个强有力的平台，同时也可应用于其他需要结合电生理与功能脑成像优势的神经科学研究领域³。