活体斑马鱼胚胎中的双光子诱导光激活

摘要

多光子显微镜能够调控低能量光子，实现深层光学穿透并降低光毒性。我们介绍了该技术在斑马鱼胚胎活细胞标记中的应用。该方案可轻松适用于多种光响应分子的光诱导实验。

摘要

在活体生物中对目标化合物进行光激活已被证明是研究多种生物过程（如胚胎发育、细胞信号传导和成体生理功能）的有效方法。在此方面，多光子显微技术能够在深层组织中以单细胞分辨率对特定光响应试剂实现定量光激活。由于斑马鱼胚胎具有光学透明性，其发育过程可进行活体（in vivo）监测。这些特性使斑马游戏副本成为通过聚焦光精确控制多种化学试剂和蛋白质活性的理想模式生物。本文描述了利用双光子显微镜诱导化学封闭型荧光素激活的方法，从而实现对活体斑马鱼胚胎中细胞命运的追踪。我们利用表达活体遗传标记（GFP）的胚胎来定位并精确靶向任意目标细胞。该方法同样适用于蛋白质、激素、小分子及其他封闭型化合物的精确光诱导激活。

方案

我们描述了一种使用笼状荧光素进行细胞标记的方案，但其他光激活染料和蛋白质也可采用类似方法使用。

1. 注射笼锁型荧光素

1. 制备5%储备液（5 mg 二甲氧基硝基苄基（DMNB）偶联荧光素/100 μL 0.2 M KCl），其中Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein为10,000 MW葡聚糖，阴离子型，购自Invitrogen, Molecular Probes, Carlsbad, CA，货号D-3310。分装后于-20°C保存。注意DMNB-偶联荧光素对光敏感，应避光保存。
2. 按照《斑马鱼手册》¹中的描述，制备由1%琼脂糖（Sigma, St. Louis, MO，货号A9539）制成的注射槽。
3. 通过稀释100倍浓度的E3储备液，制备2升E3培养基。
4. 在注射前一晚，设置交配笼，将所需转基因品系中表达可见荧光标记（如GFP、RFP等）的雄鱼与雌鱼分隔开，该荧光标记用于定位光激活的目标细胞。
5. 使用拉针仪（Sutter Instrument, Novato, CA, P-97）制备毛细玻璃注射针（Thin Wall Glass Capillaries with filament，World Precision Instruments, Sarasota, FL，货号TW100F-6）。
6. 将一份5%的笼锁荧光素溶液置于冰上解冻。
7. 用0.2 M KCl将5%笼锁荧光素储备液稀释至终浓度为1%，并保持在冰上。避免光照。
8. 设置第4步中准备好的交配组合。
9. 一旦受精卵产出，立即收集。将单细胞期胚胎置于覆盖有E3¹的琼脂糖注射模具中进行定向排列。
10. 使用移液器吸头（Microloader tip，Eppendorf, Hamburg, Germany，货号5242 956.003）从针尖后方填充约1 μL的1%笼锁荧光素溶液至注射针中。
11. 将装有溶液的注射针安装至连接气动微量注射仪（pneumatic picopump，World Precision Instruments, Sarasota, FL, PV820）的显微操作器上。
12. 调节注射体积至2–3 nl，直接将笼锁荧光素注入细胞质中。每次实验至少注射50个胚胎。
13. 将胚胎在E3培养基中于28.5°C避光孵育至所需发育阶段。若分析受精后超过24小时的胚胎，需加入0.1%苯硫脲（PTU，Sigma, St. Louis, MO，货号22290-9）以抑制色素形成。

2. 胚胎固定

1. 制备新鲜的 E2 溶液（参见溶液部分；可在 4°C 下保存一周）。
2. 用溶解于 E2 培养基中的 1% 琼脂糖在 60 mm 培养皿上覆盖一层薄层。
3. 制备用于包埋的 2% 低熔点琼脂糖（Ultra Pure LMP 琼脂糖，Invitrogen，Carlsbad, CA，货号 16520100）：将琼脂糖溶于无菌双蒸水中，微波加热至沸腾。加热过程中保持离心管盖打开。分装 1 mL 至微量离心管中，并置于 72°C 加热金属块中保温。
4. 用尖头镊子（No. 5）轻轻撕开胚胎的绒毛膜以去除绒毛膜。将胚胎保留在涂有琼脂糖的培养皿中的 E2 溶液内（见步骤 2）。去膜后的胚胎应使用火焰抛光的玻璃巴斯德吸管操作，因为它们可能粘附于聚丙烯吸头。避免将去膜胚胎暴露于空气中，以免液体表面张力对其造成损伤。
5. 用火焰抛光的玻璃巴斯德吸管吸取少量 E2 溶液中的目标胚胎，并将其置于 60 mm 培养皿中。在胚胎旁滴加一滴约 150 μL 的 2% 琼脂糖（步骤 3）。迅速混合两滴液体，形成均匀的终浓度约为 1% 的琼脂糖混合物，并在解剖显微镜下调整胚胎方向，使其背侧朝向物镜。
6. 等待琼脂糖凝固后，加入 E2 培养基直至包埋的胚胎完全浸没于液体中。建议每个培养皿中仅包埋一个胚胎，以便在光激活过程后可将其从琼脂糖中释放出来。

3. 光激活

1. 我们使用配备 Spectraphysics 公司生产的宽带可调谐（700–1020 nm）Mai Tai-HP 飞秒激光器的蔡司 LSM 510 META NLO 双光子显微镜。
2. 将固定好的胚胎置于显微镜下的载物板支架上。使用 40×/0.8W Achroplan 水浸物镜观察胚胎中的荧光标记。在后续步骤中，使用非共聚焦检测器（NDD）并配备 500–550 nm 带通滤光片（BP）。
3. 在进行光激活之前，需获取感兴趣区域的空间荧光信息：使用双光子激光波长 860 nm（用于 GFP 检测），从检测到的荧光信号最腹侧至最背侧采集一系列图像。为此，各焦平面之间间隔 6 μm 即可获得足够的分辨率。
4. 选择用于光激活的目标 z 平面，并将该区域调至焦点。根据实验目的，感兴趣区域可位于 GFP 可见标记之内或之外。在此 z 平面采集一幅单层图像，保存该图像并保留在单独窗口中。
5. 将双光子激光波长设为 720 nm，当激光处于锁模状态时，打开“Edit bleach”（编辑漂白）菜单。根据在 860 nm 下采集的图像（步骤 4）使用“Define Region”（定义区域）菜单定义光激活的感兴趣区域（ROI）。在将激光波长切换至 720 nm 后，必须基于该图像选择 ROI，因为此操作会改变观察视野的 x、y 位置。
6. 在“Edit bleach”菜单中调整以下光激活参数（见步骤 9）：a）相对激光功率；b）扫描迭代次数；c）扫描速度。
7. 点击“Edit bleach”窗口中的“Bleach”（漂白）按钮，等待激光停止。
8. 切换回 860 nm 波长，采集一幅单层图像以评估光激活后产物的荧光强度，并再采集一组图像序列以评估激活区域在 z 轴方向的跨度（厚度）。
9. 进行光激活时需考虑以下参数：
   1. 应通过改变两个参数——激光强度和光激活持续时间——来经验性地确定最佳光激活条件。相对激光功率可通过声光调制器（AOM）的透射率进行控制。光激活持续时间取决于扫描迭代次数和扫描速度。
   2. 需确定荧光强度的线性范围，以避免解笼锁荧光信号的饱和。
   3. 解笼锁分子所获得的荧光强度与光激活克隆在 z 轴方向的跨度之间存在线性相关性²。

4. 解笼荧光素的检测

1. 光激活后，将胚胎置于含0.1% PTU的E2培养基中，在28.5°C避光培养，以防止皮肤色素形成。
2. 在所需发育阶段，于解剖显微镜下将胚胎从琼脂糖中取出。使用尖头解剖刀，在靠近胚胎的琼脂糖上制作一个“V”形切口，使“V”形的尖端指向胚胎头部。将闭合的镊子置于“V”形尖端靠近胚胎头部的位置，轻轻撑开镊子，沿胚胎长度方向分离琼脂糖，使胚胎释放到培养基中。
3. 用火焰抛光的巴斯德移液管收集胚胎，并用多聚甲醛（PFA；4%溶于1×PBS，pH 7.2）固定，可在室温下固定3小时，或在4°C过夜。
4. 去除固定液，用PBST在室温下清洗2–3次，每次至少5分钟。
5. 用100%甲醇洗涤胚胎10分钟，更换新鲜甲醇，并在-20°C孵育至少2小时。
6. 通过一系列PBSTr中稀释的甲醇（80%、60%、40%和20%）依次孵育（每次5分钟）使胚胎复水。在PBSTr中洗涤2次，每次10分钟。
7. 在500 μL封闭液中室温孵育30分钟。
8. 加入抗荧光素-碱性磷酸酶（AP）Fab片段（Roche，Palo Alto，CA，货号11426338910），用封闭液按1:500稀释，4°C孵育过夜（将微量离心管侧放）。
9. 用PBST洗涤5次，每次15分钟。
10. 在TNT中的0.2 M NaCl中洗涤5分钟。
11. 在TNT中的0.4 M NaCl中洗涤5分钟。
12. 用新鲜配制的预染液平衡3次，每次5分钟。
13. 将一片Fast Red试剂片（Roche，Palo Alto，CA，货号11496549001）溶于2 mL预染液中。建议使用Whatman No. 2滤纸过滤溶液以去除未溶解颗粒；或者离心后取上清液使用。
14. 向每管中加入500 μL Fast Red溶液，在室温避光孵育，并监测显色情况，直至达到理想的信噪比（20分钟至数小时）。若背景过深，可转移至4°C。孵育1小时后，更换新的Fast Red染色液。
15. 通过3次、每次5分钟的PBST洗涤终止染色反应。
16. 在室温下用4% PFA固定20分钟。
17. 用PBST洗涤2次，每次5分钟。
18. 通过一系列含25%、50%和75%甘油的PBS溶液逐步透明胚胎，直至胚胎沉降至管底。胚胎可在4°C保存数天。

5. 解笼区域的荧光可视化

1. 准备用于封片的显微镜载玻片：使用1 mL注射器在载玻片上滴加四点透明硅脂，各点之间相距约15 mm。将胚胎置于中央，加入约200 μL 75%甘油，盖上盖玻片（0号；18×18 mm），轻轻按压盖玻片使其紧贴硅脂，直至甘油溶液充满载玻片与盖玻片之间的区域。
2. 将封好的胚胎样本置于显微镜载物台上，使用40倍物镜调焦。采用488 nm氩离子激光和543 nm氦氖激光作为激发光源，获取共聚焦Z轴系列图像。
3. 可通过图像分析软件对解笼胚胎进行三维重建，分析光激活区域的Z轴范围。

6. 溶液

100 x E3	174 mM NaCl, 21 mM KCl, 12 mM MgSO4, 18 mM Ca(NO3), 15 mM HEPES, pH = 7.4。通过过滤灭菌后，于 4°C 保存
20 x E2	0.3 M NaCl, 10 mM KCl, 20 mM CaCl2*2HOH, 20 mM MgSO4*7HOH, 3 mM KH2PO4, 0.8 mM Na2HPO4*2HOH，过滤后于室温保存
1 x E2	将 20 x E2 用双蒸水稀释，并加入新配制的 NaHCO3（终浓度为 0.7 mM）、青霉素和链霉素（将青霉素-链霉素溶液稀释至终浓度为 1 x，即每毫升含 100 U 青霉素和 100 mg 链霉素（Invitrogen, Carlsbad, CA, 货号：15140-122））
PBST	含 0.1% TWEEN-20 的 PBS 溶液
PBSTr	含 0.3% Triton 的 PBS 溶液
封闭液	含 10% BSA、0.3% Triton 和 1% DMSO 的 PBS 溶液
TNT	100 mM Tris-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.5% TWEEN-20 溶于双蒸水中
预染液	100 mM Tris-HCl（pH 8.2）、0.4 M NaCl、0.1% TWEEN-20 溶于双蒸水中

7. 代表性结果

本文展示了双光子显微镜在活体斑马鱼胚胎中光激活试剂的应用实例。我们此前采用类似方法追踪了光激活标记的神经前体细胞在斑马鱼大脑中的谱系^2,3。图1显示了在携带neurog1::gfp报告转基因的斑马鱼胚胎前部神经板中，对一种笼锁型荧光素偶联示踪染料进行光激活的结果，该转基因表达可作为活体内部标记。

在单细胞期将胚胎注射笼锁型荧光素，并在出芽期将其包埋于琼脂糖中。在3-5体节期，测量neurog1::gfp转基因胚胎中的空间坐标，以确定光解笼锁的感兴趣区域（ROI）（图1A，A'）。随后，在神经板的特定区域进行荧光素谱系示踪剂的光解笼锁（图1B，B'）。接着，通过免疫染色检测光解后的荧光素，在prim5期（受精后24小时）确定该标记的神经前体细胞亚区的命运（图1C，C'）。

双光子激光解笼的范围，即解笼后荧光的强度以及光激活区域的厚度（z轴跨度），可通过调节两个参数来控制：激光强度和作用时间。后者可通过调整迭代次数和扫描速度来实现（见第3部分，步骤9；Russek-Blum，2009）。在图1所示的示例中，我们使用了相对激光功率为12% AOM透射率、20次迭代以及25.6 μsec/像素的扫描速度。采用这些设置，我们标记了一个包含9-10个细胞的感兴趣区域（ROI），光激活的z轴跨度为30 μm（约1-2层细胞）。

图1. 使用双光子显微镜在活体斑马鱼胚胎中光解笼锁型荧光素的代表性结果。

光激活过程的示意图（A-C）和代表性图像（A'-C'）。在1细胞期注射了笼锁型荧光素示踪染料的活体斑马鱼胚胎（A, A'），其在神经原蛋白1启动子（neurog1::gfp）控制下表达GFP。在3-5体节期，前脑原基（间脑）的一个特定区域被光激活，可检测到解笼锁的荧光素示踪染料（B, B'）。光激活处理后，胚胎在28.5°C下培养，并在受精后24小时（hpf；C, C'）通过抗荧光素免疫染色追踪含有解笼锁荧光素的脑细胞。Dien.，间脑；Tel.，端脑。

讨论

光可激活化合物是一类功能被屏蔽的分子，只有在特定波长（通常为紫外光）照射下才会发生光化学反应，从而转化为具有生物或化学活性的状态。这类探针为细胞生物学研究提供了极为强大的工具，因为通过控制光照的时间和空间范围，可以精确地调控其激活过程。

多光子显微镜的一个显著优势是其相对较深的光学穿透能力和较低的非特异性光毒性。在激活过程中，光可激活化合物必须同时吸收两个低能量光子。由于该事件发生的概率取决于光子密度，因此激活被限制在焦平面内。因此，可以在组织内的特定体积中对激活区域进行选择性操控。

我们介绍了一种利用双光子显微镜在活体斑马鱼胚胎中进行笼锁型荧光素光激活的实验方案。在本文展示的具体示例中，我们采用双光子显微镜诱导笼锁型荧光素的光解反应，以在胚胎发育早期标记细胞，随后追踪这些标记细胞在发育中斑马鱼脑内的谱系。与激光或闪光灯照射的光激活方法相比（这些方法仅能在数十个细胞内激活示踪染料，且在z轴方向缺乏分辨率^4,5），基于双光子的光激活技术可实现数微米的空间分辨率，轴向分辨率可达大约一到两层细胞的范围

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
荧光素偶联的葡聚糖-4,5-二甲氧基-2-硝基苄基（DMNB）笼锁化合物（10,000 分子量葡聚糖，阴离子型）	Invitrogen	D-3310	molecular probes
用于注射槽和包被培养板的琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9539
带内丝的薄壁玻璃毛细管	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-6
微电极拉制仪	Sutter Instrument Co.	P-97
微量移液器上样尖端（Microloader tip）	Eppendorf	5242 956.003
气动皮升注射泵（Pneumatic picopump）	World Precision Instruments, Inc.	PV820
苯硫脲（Phenylthiourea, PTU）	Sigma-Aldrich	22290-9
用于胚胎固定的低熔点琼脂糖	Ultra Pure LMP agarose	16520100
抗荧光素-碱性磷酸酶（AP）Fab 片段	Roche Group	11426338910
Fast Red	Roche Group	11496549001