多光子显微镜能够调控低能量光子，实现深层光学穿透并降低光毒性。我们介绍了该技术在斑马鱼胚胎活细胞标记中的应用。该方案可轻松适用于多种光响应分子的光诱导实验。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
在活体生物中对目标化合物进行光激活已被证明是研究多种生物过程（如胚胎发育、细胞信号传导和成体生理功能）的有效方法。在此方面，多光子显微技术能够在深层组织中以单细胞分辨率对特定光响应试剂实现定量光激活。由于斑马鱼胚胎具有光学透明性，其发育过程可进行活体（in vivo）监测。这些特性使斑马游戏副本成为通过聚焦光精确控制多种化学试剂和蛋白质活性的理想模式生物。本文描述了利用双光子显微镜诱导化学封闭型荧光素激活的方法，从而实现对活体斑马鱼胚胎中细胞命运的追踪。我们利用表达活体遗传标记（GFP）的胚胎来定位并精确靶向任意目标细胞。该方法同样适用于蛋白质、激素、小分子及其他封闭型化合物的精确光诱导激活。
方案
我们描述了一种使用笼锁型荧光素进行细胞标记的方案，但其他光激活染料和蛋白质也可类似地使用。
1. 注射笼锁型荧光素
- 制备5%储备液（5 mg 二甲氧基硝基苄基（DMNB）笼锁型荧光素/100 μL 0.2 M KCl），其中含右旋糖酐偶联的4,5-二甲氧基-2-硝基苄基（DMNB）笼锁型荧光素（10,000 MW 右旋糖酐，阴离子型，Invitrogen，Molecular Probes，Carlsbad，CA，货号 D-3310）。分装后于-20°C保存。注意DMNB笼锁型荧光素对光敏感，应避光保存。
- 按照《斑马鱼手册》1 中所述方法，制备由1%琼脂糖（Sigma，St. Louis，MO，货号 A9539）制成的注射槽。
- 通过稀释100倍浓度的E3储备液，制备2升E3培养基。
- 在注射前一晚，设置交配笼，将所需转基因品系中表达可见荧光标记（如GFP、RFP等）的雄鱼与雌鱼分隔开，该荧光标记用于定位光激活的目标细胞。
- 使用拉针仪（Sutter Instrument，Novato，CA，P-97）制备毛细玻璃注射针（带内丝薄壁玻璃毛细管，World Precision Instruments，Sarasota，FL，货号 TW100F-6）。
- 将一份5%笼锁型荧光素溶液置于冰上解冻。
- 用0.2 M KCl将5%笼锁型荧光素储....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
光可激活化合物是一类功能被屏蔽的分子，只有在特定波长（通常为紫外光）照射下才会发生光化学反应，从而转化为具有生物或化学活性的状态。这类探针为细胞生物学研究提供了极为强大的工具，因为通过控制光照的时间和空间范围，可以精确地调控其激活过程。
多光子显微镜的一个显著优势是其相对较深的光学穿透能力和较低的非特异性光毒性。在激活过程中，光可激活化合物必须同时吸收两个低能量光子。由于该事件发生的概率取决于光子密度，因此激活被限制在焦平面内。因此，可以在组织内的特定体积中对激活区域进行选择性操控。
我们介绍了一种利用双光子显微镜在活体斑马鱼胚胎中进行笼锁型荧光素光激活的实验方案。在本文展示的具体示例中，我们采用双光子显微镜诱导笼锁型荧光素的光解反应，以在胚胎发育早期标记细胞，随后追踪这些标记细胞在发育中斑马鱼脑内的谱系。与激光或闪光灯照射的光激活方法相比（这些方法仅能在数十个细胞内激活示踪染料，且在z轴方向缺乏分辨率4,5），基于双光子的光激活技术可实现数微米的空间分辨率，轴向分辨率可达大约一到两层细胞的范围
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
感谢 Genia Brodsky 提供图示插图；感谢 Vyacheslav Kalchenko、Douglas Lutz 和 Leonid Roitman 在双光子解笼技术方面的技术指导与协助；感谢 Maayan Tahor 和 Suliman Elsadin 提供的技术支持；感谢 Uwe Strahle 慷慨提供 neurogenin1 报告基因品系，以及 Amos Gutnick 对本稿件的宝贵意见。Levkowitz 实验室的研究工作得到德国-以色列基金会（资助号 183/2007）、以色列科学基金会（资助号 928/08）以及 Harriet & Marcel Dekker 基金会的支持。G.L. 是 Tauro 职业发展讲席（生物医学研究）现任持有者。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 荧光素偶联的葡聚糖-4,5-二甲氧基-2-硝基苄基（DMNB）笼锁化合物（10,000 分子量葡聚糖，阴离子型） | Invitrogen | D-3310 | molecular probes |
| 用于注射槽和包被培养板的琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| 带内丝的薄壁玻璃毛细管 | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-6 | |
| 微电极拉制仪 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| 微量移液器上样尖端（Microloader tip） | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| 气动皮升注射泵（Pneumatic picopump） | World Precision Instruments, Inc. | PV820 | |
| 苯硫脲（Phenylthiourea, PTU） | Sigma-Aldrich | 22290-9 | |
| 用于胚胎固定的低熔点琼脂糖 | Ultra Pure LMP agarose | 16520100 | |
| 抗荧光素-碱性磷酸酶（AP）Fab 片段 | Roche Group | 11426338910 | |
| Fast Red | Roche Group | 11496549001 |
参考文献
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio. , University of Oregon Press. (1995).
- Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
- Russek-Blum, N.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
